پایان نامه بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim-up در زمان های مختلف

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim-up در زمان های مختلف دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:120

پایان نامه ی دوره ی کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی سلولی و مولکولی

فهرست مطالب:
عنوان                                                                                                          صفحه
فصل اول- مقدمه..........................................................................................................................................................1
1-1- روش های کمک باروری..................................................................................................................................2
1-2- ناباروری...............................................................................................................................................................5
1-3- تولید اسپرم .......................................................................................................................................................5
1-4- مایع انزالی...........................................................................................................................................................6
1-4-1- آنالیز مایع انزالی...........................................................................................................................................7
1-5- پارامترهای اسپرم...........................................................................................................................................10
1-5-1- مورفولوژی...................................................................................................................................................10
1-5-2- تحرک اسپرم..............................................................................................................................................12
1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم ......................................................................................................................14
1-5-4- قابلیت حیات اسپرم..................................................................................................................................14
1-5-5- حجم.............................................................................................................................................................15
1-5-6- غلظت...........................................................................................................................................................16
1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن.....................................................................................................................18
1-6-1- نکروز............................................................................................................................................................18
1-6-2- آپوپتوز سلولی............................................................................................................................................18
1-6-2-1 مراحل آپوپتوز ........................................................................................................................................19
1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز..................................................................................................................................21
1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز.......................................................................................................21
1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز .................................................................................................................23
1-6-2-4-1-  بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول .....................................................................23
1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول............................................................24
1-6-2-4-2-  بررسی سیتوتوکسیسیتی ............................................................................................................24
1-6-2-4-3-  بررسی تغییرات مورفولوژی ........................................................................................................25
1-6-2-4-3-1-  استفاده از میکروسکوپ الکترونی..........................................................................................25
1-6-2-4-3-2-  استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس..........................................................................25
1-7-  منشاء آسیب DNA اسپرم........................................................................................................................26
1-7-1-  بسته بندی غیرطبیعی کروماتین.........................................................................................................27
1-8-  ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری ....................................................................................28
1-8-1-  بررسی ساختار کروماتین اسپرم...........................................................................................................28
1-9-  نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم.....................................................................................................29
1-10-  استرس اکسیداتیو به واسطه ROS......................................................................................................30
1-11-  تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA  و میزان موفقیت روشهای کمک باروری.......................31
1-11-1-  مصرف سیگار.........................................................................................................................................31
1-11-2-  مواجهات شغلی.....................................................................................................................................32
1-11-3-  داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی................................................................................................33
1-11-4-  سن...........................................................................................................................................................33
1-12-  تکنیک¬های بررسی ساختار کروماتین....................................................................................................33
1-12-1-  روش¬های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان.................................................................................34
1-12-1-1- تست TUNEL...............................................................................................................................35
1-12-1-2- روش DBD-FISH.......................................................................................................................35
1-12-1-3- روش Comet...................................................................................................................................36
1-12-1-4- رنگ¬آمیزی CMA3........................................................................................................................36
1-12-1-5- تکنیک SCSA................................................................................................................................37
1-12-1-6- تست  SCD......................................................................................................................................37
1-12-1-7- رنگ¬آمیزی آکریدین اورانژ..............................................................................................................39
1-12-1-8- رنگ¬¬آمیزی تولوئیدین بلو................................................................................................................39
1-13- روش مهاجرت اسپرم..................................................................................................................................39
1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت...................................................................................................................40
فصل دوم- مواد و روش ها.......................................................................................................................................41
2-1- مواد و وسایل  مورد نیاز.................................................................................................................................42
2-1-1- وسایل مورد نیاز...........................................................................................................................................42
2-1-2- مواد مورد نیاز...............................................................................................................................................42
2-2- ساخت محلول های مورد نیاز........................................................................................................................45
2-2-1- ساخت محلول Ham's F10...................................................................................................................45
2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)..................................................46
2-2-3- ساخت محلول تانل......................................................................................................................................46
2-2-4- ساخت محلول (PBS)...............................................................................................................................46
2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین...................................................................................................................47
2-2-6- ساخت رنگ رایت.........................................................................................................................................47
2-3- روشها....................................................................................................................................................................48
2-3-1- روش جمع آوری اسپرم............................................................................................................................. 48
2-3-2- آنالیز مایع انزالی.......................................................................................................................................... 48
2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی..........................................................................................................................48
2-3-2-1-1-  ظاهر....................................................................................................................................................48
2-3-2-1-2- آبکی کردن..........................................................................................................................................48
2-3-2-1-3-  حجم....................................................................................................................................................48
2-3-2-1-4-  چسبندگی..........................................................................................................................................48
2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی.........................................................................................................................49
2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون......................................................................................................................................50
2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم..........................................................................................................................50
2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش ...............................................50
2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک....................................................................................................................................51
2-3-2-2-3-1- روش کار........................................................................................................................................52
2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات........................................................................................................................53
2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین.................................................................................53
2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی..............................................................................................................................54
2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا..................................................................................................................54
2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن.......................................................................................................................54
2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا.........................................................................................................55
2-3-3-  Direct swim-up.......................................................................................................................................57
2-3-3-1- روش کار....................................................................................................................................................57
2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD).....................................................................58
2-3-4-1- روش کار...................................................................................................................................................58
2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل.................................................................................................................................60
2-3-6- آنالیز آماری....................................................................................................................................................62
فصل سوم- نتایج...........................................................................................................................................................63
3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی تحرک اسپرم....................................64
3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قابلیت حیات اسپرم......................67
3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی مورفولوژی اسپرم..........................68
3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم...............................................................................................................................................................................70
3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم..............................................................................................72
3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی آپوپتوز اسپرم..............................................................................................................................75
3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم..........................................78
3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم.............................................................................79
3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم..................................................80
3-10- نتایج کلی......................................................................................................................................................80
فصل چهارم- بحث....................................................................................................................................................81
4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم.............................................83
4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم...................................................................................................................................84
4-3- پیشنهادات.......................................................................................................................................................90
منابع
چکیده انگلیسی
 
فهرست شکل ها
عنوان                                                      صحنه
 1-1- ساختار اسپرم انسانی......................................................................................................................................9
1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: …………..…………….…A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337
1-3- تست  SCD....................................................................................................................................................38
2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون..........................................................................................................................50
2-2- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود......................................................51
2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER .................................................................................................52
2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور.............................................................57
3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم..................................67
3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا ..................................................................................................................................69
3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد..........................................74
 3-4- رنگ آمیزی TUNEL..................................................................................................................................76


فهرست جدول ها
عنوان                                                   صفحه
1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO).......................................................................................................................................................17
2-1- ساخت Ham'sf10......................................................................................................................................45
2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا..........................................................................................55
3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ..............................................................71
3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم............................................77
3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم.........................................77
3-4- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم..........................................78
3-5- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم............................................................................79


فهرست نمودارها
عنوان                                                        صفحه
3-1- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده، حرکت سریع و حرکت کند قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Swim-up.................................................................................................................................................66
3-2- مقایسه میانگین قابلیت حیات و مورفولوژی اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش  Swim-up................................................................................................................................................................................68
3-3- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش   Swim-up..................................................................................................................................................70
3-4- مقایسه میانگین قطعه قطعه شدن DNA  اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش  Swim-up...................................................................................................................................73
3-5- مقایسه میانگین آپوپتوز  اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش  Swim-up...............................................................................................................................................................76
 


فصل اول

مقدمه

1-1- روش های کمک باروری
امروزه استفاده از روش های کمک باروری ( ART) بهترین گزینه برای رفع مشکلات زوج های نابارور است. میزان موفقیت این روش ها به عوامل متعددی از جمله سلامت کامل تخمک و اسپرم بستگی دارد. در این میان سلامت ژنوم پدری اهمیت زیادی در میزان پتانسیل باروری زوج ها دارد. بنابراین آسیب DNA اسپرم یک اختلال ژنومی است که به میزان متفاوت در مردان نابارور وجود دارد. از زمانی که اولین گزارش در مورد آسیب DNA اسپرم منتشر شد مطالعات وسیعی در این زمینه انجام گرفته و مشخص شده که در افراد دارای میزان بالای آسیب DNA، پارامترهای اسپرمی پایین می آید و قدرت باروری نیزکاهش می یابد.
از سالها پیش، استفاده از جراحی برای رفع نقایص ساختمان دستگاه تولید مثل، استفاده از داروهای باروری برای تحریک تخمک¬گذاری و روش IUI  (انتقال اسپرم متحرک و شسته شده به رحم) از جمله روش¬های رایج درمانی بوده و هستند. لیکن این اقدامات تنها برای گروهی از زوج¬های نابارور مؤثر است. این در حالی است که روش¬های جدیدی از جمله IVF   و ICSI   امروزه به عنوان گزینه¬هایی مناسب  در درمان سایر زوجین نابارور مطرح است.
میزان موفقیتART  به سلامت و بلوغ گامت های زوجین وابسته است . طی لقاح طبیعی و روش لقاح آزمایشگاهیIVF احتمال نفوذ اسپرماتوزوای غیربالغ و ناسالم به داخل تخمک توسط سد زوناپلوسیدا به حداقل می رسد در صورتی که در روش میکرواینجکشن یا تزریق مستقیم اسپرم به داخل سیتوپلاسم تخمک ICSI این سد وجود نداشته و ایمن بودن روش ICSI همیشه مورد نگرانی بوده است . در ضمن تحقیقات نشان داده است که انتخاب اسپرم با پارامترهای معمولی (غلظت، مورفولوژی، تحرک ) نمی تواند گویای سلامت DNA اسپرم باشد(EI, MI, López-Fernández, Fernández, & Gosálvez, 2007).  به تازگی لوئیس و سیمون (2010) اظهار داشتند که هیچ همبستگی بین پارامتر های معمولی اسپرم و آسیب DNA وجود ندارد(S. E. M. Lewis & Simon, 2010).
یکی از روش های کمک باروری روش تلقیح داخل رحمی (IUI)  می باشد. که در این روش مایع انزالی از شوهر گرفته می شود و پس از عمل شستشو و جداسازی ، اسپرم های مرده و بدون تحرک از اسپرم های زنده و دارای تحرک جدا می شوند، سپس اسپرم های زنده و متحرک به وسیله کاتتر توسط متخصص، وارد حفره رحم می گردد.
در آزمایشگاه های ART، بعد از عمل شستشو و جداسازی معمولاَ به بررسی پارامترهای اسپرم که شامل تعداد، میزان تحرک و وضیعت مورفولوژیکی اسپرم و درصد زنده بودن می باشد، می پردازند اما به بررسی پارامترهای درون سلولی که شامل آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم است پرداخته نمی شود. همچنین در آزمایشگاه های ART معمولاَ انجام روش IUI  از 5/0 تا حداکثر 3 ساعت بعد از عمل جداسازی و شستشو اسپرم انجام می دهند و در بعضی از مراکز درمان ناباروری بدون توجه به زمان، عمل تلقیح را انجام می دهند. با توجه به نقش اسپرم در پروسه لقاح در روش IUI، لازم است که علاوه بر توجه به ساختار سلولی اسپرم به بهترین زمان ممکن جهت انجام تزریق اسپرم آماده شده به داخل حفره رحمی توجه شود. لذا با مطالعه ساختار سلولی اسپرم و نیز تعیین زمان دقیق عمل تزریق اسپرم به داخل حفره رحمی  می توان میزان لقاح و در نتیجه میزان حاملگی را افزایش داد.
یکی از عواملی که می تواند بر میزان موفقیت درمان زوج های نابارور و همچنین کیفیت گامت ها مهم باشد، کیفیت اسپرم است. در روش IUI بعد از جداسازی اسپرم از مایع منی و آماده سازی اسپرم برای انتقال، می تواند به خاطر انکوباسیون طولانی مدت، قطعه قطعه شدن DNA اسپرم افزایش پیدا کند(Muratori, et al., 2003).
مطالعات بیانگر این مطلب است که در تخمک های لقاح یافته با اسپرم های دارای آسیب بالای DNA، میزان لانه گزینی و بارداری به طور معنی داری کاهش می یابد . اگرچه ژنوم آسیب دیده پدری، طی رشد جنینی می تواند دستخوش پردازش قرار گیرد، ولی در صورت وجود آسیب های زیاد، احتمال کاهش رشد جنین وجود داشته و اگر میزان نقص ها کمتر باشد، می تواند نقایص بعد از تولد را به همراه داشته باشد. به همین دلیل، در دسته ای از بیماران، نوزادان متولد شده توسط روش ICSI دارای نقص ژنتیکی بیشتری نسبت به نوزادان طبیعی هستند .لازم به ذکر است که تحقیقات متعدد در این زمینه، نتایج ضد و نقیصی را گزارش کرده اند(Morris, Ilott, Dixon, & Brison, 2002).
تجربیات به دست آمده از روش های کمک باروری نشان می دهد، چنانچه اسپرم با میزان بالایی از آسیب DNA، در روند IVF و ICSI وارد تخمک شود سیستم ترمیمی تخمک ممکن است توانایی ترمیم این آسیب ها را نداشته و در بسیاری از موارد با وجود موفقیت در لقاح، سلول های جنسی توانایی تشکیل جنین یا ادامه تکامل را تا مرحله بعد از 4 تا 8 سلولی که مصادف با فعال شدن ژنوم است، ندارند . براساس تحقیقات مشخص شده که توانایی ترمیم تخمک وابسته به سن مادر بوده و تخمک های افراد جوان، از قدرت ترمیم DNA بالایی برخوردارند . به علاوه تحقیقات متعدد در زمینه آسیب DNA بیانگر این هستند که ارتباط معنی داری بین آسیب DNA و میزان لقاح وجود ندارد ولی بین آسیب DNA اسپرم و تشکیل جنین، بلاستوسیت، رشد جنین و بارداری ارتباط معکوس و معنی داری وجود دارد(Morris, et al., 2002).
پس از آماده سازی اسپرم به طور معمول در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود تا در ART از آن استفاده شود (Van der Westerlaken, Naaktgeboren, Verburg, Dieben, & Helmerhorst, 2006) ، ولی هنوز زمان بهینه برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد قبل از استفاده در ART وجود ندارد. بعضی از محققین سعی برای پیدا کردن اثر گذشت زمان بر پارامترهای اسپرم بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی گراد را دارند. اثر انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان داد که بعد از گذشت 24 ساعت می تواند بر روی تحرک و قابلیت حیات اسپرم تاثیر گذار باشد(Calamera, Fernandez, Buffone, Acosta, & Doncel, 2001).
بعد از آماده سازی اسپرم برای استفاده در تکنیک های ART انکوباسیون کوتاه مدت در دمای 37 درجه سانتی گراد می تواند باعث ظرفیت یابی اسپرم شود اما انکوباسیون طولانی مدت می تواند بر روی DNA اسپرم تاثیر داشته باشد(Marı́n-Briggiler, Tezón, Miranda, & Vazquez-Levin, 2002).