جداسازی گازها با استفاده از غشاء

اختصاصی از کوشا فایل جداسازی گازها با استفاده از غشاء دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : pdf

تعداد صفحه :15

دراین تحقیق ابتدا به تاریخچه جداسازی گاز با غشا پرداخته شده است.سپس تعریف غشا و انواع ان اورده شده است و بعد از ان غشا هارا بر اساس هندسه انها تقسیم کرده است.و در اخر به غشا های انتخاب گر پرداخته شده است و شرح عملیات جداسازی گاز با غشاء.

(تحقیقی کامل و جامع در مورد جداسازی گاز با غشا که به صورت جزء به جزء  همه ی  مطالب در این مورد را پوشش داده است که بیشتر به یک فصل از پایان نامه شباهت دارد تا یک تحقیق )

فهرست مطالب:

مقدمه ای بر جداسازی گازها با غشا

 

1- خلاصه ای بر روند جداسازی غشایی

 

2-غشاء

 

3- تقسیم بندی غشاها بر اساس جنس غشاء

 

- غشاهای پلیمری

 

- غشاهای معدنی

 

- غشاهایسرامیکی

 

- غشاهای فلزی

 

- غشاهایمایع

 

4- تقسیم بندی غشاها بر اساس شکل هندسی غشاء

 

5- تقسیم بندی بر اساس ساختارغشاء

 

6- جداسازی گازی

 

7- غشاهای انتخابگر دی اکسید کربن

 

- غشاهای پلیمری

 

- غشاهای ماتریس آمیخته

 

3 غشاهای زئولیت

 

خلاصه :

غشاء به عنوان یک فاز که اجزای خوراک به صورت  انتخابی از آن عبور می کنند، تعریف می گردد. به عبارت بهتر، غشاءبه صورت فازی که اجزای جداشونده خوراک با سرعت های متفاوت از آن عبور می کنند، عمل می کند. در این روش، معمولاً تغییر فازی صورت نمی گیرد و محصولات نیز در همدیگر قابل امتزاج هستند.

  در فرآیندهای غشایی، جزئی ازخوراک که از غشاء عبور می کند به نام تراوش کرده و بخشی که نتوانند از غشاء عبور کند، نگه داشته شده نامیده می شود که بر اساس هدف جداسازی، هر کدام از آنها می توانند به عنوان محصول در نظرگرفته شوند. در حالت کلی، روشهای غشایی در مواقعی که غلظت مواد کم باشد، کارایی بسیار زیادی دارند. نیروی محرکه لازم در فرایندهای غشایی می تواند به صورت اختلاف غلظت، فشار، دما و پتانسیل الکتریکی باشد. ساده ترین نوع غشاها بر اساس اختلاف اندازه ذرات عمل می کنند که از این نظر مشابه فیلترها هستند، ولی غشاها از لحاظ اندازه ی منافذ و توزیع اندازه ی آنها و نیز نحوه ی جریان، با فیلترها تفاوت دارند. کارایی غشاها با دو پارامترتعیین می گردند که شامل دبی عبورکرده از غشاء وگزینش پذیری غشاها است.

فرایندهای جداسازی

اختصاصی از کوشا فایل فرایندهای جداسازی دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

هزاران سال است که جداسازی مخلوطهای شیمیایی به اجزای تشکیل دهنده آنها بصورت یک هنر انجام شده است. تمدن های اولیه فنونی را برای موارد زیر توسعه داده اند: 1) استخراج از سنگهای معدنی,2)تبخیر آب دریا برای بدست آوردن نمک,3) پالایش آسفالت صخره ای, و 4) تقطیر محلولها. بدن انسان اگر دارای کلیه نمی بود, نمی توانست   به زندگی ادامه دهد- کلیه مانند غشایی عمل می کند که به طرز گزینشی آب و محصولات زاید متابولیسم را از خون جدا می کند.

جداسازی ها شامل غنی سازی , تغلیظ , خالص سازی, پالایش و منزوی سازی از دیدگاه شیمیدان ها و مهندسان شیمی مهم اند. گروه اول(شیمیدان ها) از روش های جداسازی تجزیه ای, مانند کروماتوگرافی, برای تعیین ترکیب نسبی مخلوطهای پیچیده, به طور کمی

پاورپوینت علوم هشتم،فصل اول،مخلوط و جداسازی مواد

اختصاصی از کوشا فایل پاورپوینت علوم هشتم،فصل اول،مخلوط و جداسازی مواد دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

پاورپوینتی زیبا همراه با اسلایدهایی قابل ویرایش ویژه دانش آموزان پایه هشتم

پایان نامه جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده‌ی ترکیبات آروماتیک خلیج فارس، منطقه ساحلی استان بوشهر

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده‌ی ترکیبات آروماتیک خلیج فارس، منطقه ساحلی استان بوشهر دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:123

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی (M.A)
گرایش: میکروبیولوژی

فهرست مطالب:
عنوان                                                شماره صفحه
چکیده    1
فصل اول: کلیات تحقیق
1-1- مقدمه    3
1-2- بیان مسئله    4
1-3- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق    5
1-4- ادبیات تحقیق    6
1-5- اهداف تحقیق    10
1-5-1 اهدف کلی    10
1-5-2 اهداف جزئی    10
1-5-3 اهداف کاربردی    11
1-6- سؤالات تحقیق    11
فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق
2-1- خلیج فارس    13
2-2- استان بوشهر    14
2-3- نفت و آلودگیهای نفتی    15
2-4- ورود نفت به آب دریا    17
2-5- تغییرات نفت پس از ورود به آب دریا    17
2-5-1 پراکنده شدن    18
2-5-2 پخش شدن مواد نفتی در سطح آب    18
2-5-3 حل شدن    18
2-5-4 تبخیر شدن    18
2-5-5 اکسیداسیون فتوشیمیایی    18
2-5-6 بحالت امولسیون در آمدن    19
2-5-7 قابلیت تجزیه زیستی    19
2-5-8 ته نشین شدن    19
2-6- تجزیه‌زیستی    20
2-7- معرفی هیدروکربن‌های آروماتیک    20
2-7-1 طبقه‌بندی ترکیبات آروماتیک    20
2-7-2 فرمولاسیون ترکیبات آروماتیک    21
2-7-3 خواص فیزیکی و شیمیایی    22
2-7-4 درجه سمیت ترکیبات آروماتیک    23
2-7-5 اثرات هیدروکربن‌های پلی‌آروماتیک روی سلامتی انسان‌ها و موجودات زنده    27
2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان    27
2-7-7 چه عاملی ترکیب را سرطان‌زا میکند؟    27
2-8- فنل    28
2-8-1 کلیات ترکیب فنل    28
2-8-2 نام‌گذاری    28
2-8-3 فنول‌های طبیعی    29
2-8-4 ساختمان مولکولی و خواص فیزیکی    29
2-8-5 خواص فیزیکی    29
2-8-6 تأثیر فنل بر محیط زیست و موجودات زنده    30
2-8-7 کاربردها    30
2-9- تجزیه‌زیستی    30
2-9-1 روش‌های پاکسازی بیولوژیکی    31
2-9-2 مبانی زیست‌درمانی    32
2-9-3 میکروارگانیسم‌های هوازی    32
2-9-4 میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی    32
2-9-5 مخمرها و قارچها    33
2-9-6 استفاده از بیوراکتورها    33
2-9-7 کومتابولیسم    34
2-9-8 دینیتریفیکاسیون    34
2-9-9 کمپوست کردن    34
2-9-10 درمان بیولوژیکی    34
2-10- میکروارگانیسم های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک    35
2-11- مسیر های تجزیه زیستی    36
2-11-1 تجزیه میکروبی فنل    36
2-11-2 تجزیه میکروبی نفتالین    39
فصل سوم: روش شناسی تحقیق
3-1- محیط کشت‌های مورد استفاده    44
3-1-1 محیط ONR7a    44
3-1-2 محیط (ONR7a + نفتالین) آگار    45
3-1-3 محیط) +ONR7a فنل( آگار    45
3-1-4 محیط مارین براث (MB)    45
3-1-5 محیط مارین آگار (MA)    46
3-1-6 محیط نوترینت براث (NB)    46
3-1-7 محیط نوترینت آگار (NA)    46
3-2- محلول‌ها    47
3-2-1 سرم فیزیولوژی    47
3-2-2 محلول اتیلن‌دی‌‌آمینو‌تترا‌استیک‌اسید (EDTA)    47
3-2-3 محلول Tris-Base    48
3-2-4 محلول TBE    48
3-2-5 محلول   EDTA Tris-Base- (TE)    48
3-2-6 محلول اتیدیوم بروماید    48
3-3- مواد مصرف شده در PCR    49
3-4- دستگاه‌های مورد استفاده    49
3-5- روش عملی    50
3-5-1 نمونه برداری به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده    50
3-5-2 شمارش باکتری های موجود در محیط    51
3-5-2-1 شمارش باکتری های هتروتروف    51
3-5-2-2 شمارش باکتریهای تجزیهکننده نفتالین    51
3-5-2-3 شمارش باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل    51
3-5-3 جداسازی باکتری های تجزیه کننده    51
3-5-3-1 جداسازی و غربالگری باکتری های  تجزیه کننده    51
3-5-3-2 تست های تکمیلی    52
3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتری    52
3-5-3-2-2 فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24)    52
3-5-3-2-3  سنجش حذف فنل    52
3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالین    52
3-5-4 شناسایی باکتری ها    53
3-5-4-1 استخراج DNA ژنومی با روش فنل کلروفورم    53
3-5-4-2 تعیین غلظت DNA استخراج شده    54
3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR    54
3-5-4-4 بررسی محصول PCR    54
3-5-4-5BLAST  کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها    55


فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق
4-1- نمونه برداری    57
4-2- شمارش باکتری ها    58
4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها    58
4-2-2 شمارش تعداد کل تجزیه کننده‌ها    60
4-3- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین    61
4-4- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده    62
4-4-1 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل    62
4-4-2 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتریهای تجزیه کننده نفتالین    62
4-5- تست‌های تکمیلی جهت انتخاب باکتریهایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین    63
4-5-1 سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین    63
4-5-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24)    67
4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک    71
4-5-3-1 سنجش حذف نفتالین    71
4-5-3-2 سنجش حذف فنل    73
4-6- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک    75
4-6-1 بررسی محصول PCR    75
4-6-2 BLAST کردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها    76
4-7- رسم درخت فیلوژنی برای سویهها    92
4-8- فاصله ژنتیکی بین سویهها    94


فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1- بحث و نتیجه گیری    97
5-2- پیشنهادات    100
منابع و مآخذ    101
فهرست منابع فارسی    101
فهرست منابع انگلیسی    103
چکیده انگلیسی    108


فهرست جداول
عنوان                                                شماره صفحه
جدول 2-1: 28 ترکیبات آروماتیک به ترتیب میزان سمیت    23
جدول 3-1: ترکیبات محیط کشت ONR7a    44
جدول 3-2: ترکیبات محیط کشت مارین براث (MB)    45
جدول 3-3: ترکیبات محیط کشت نوترینت براث    46
جدول 3-4: ترکیبات سرم فیزیولوژی    47
جدول 3-5: ترکیبات سرم فیزیولوژی    47
جدول 3-6: توالی و خصوصیات پرایمر‌های مورد استفاده جهت شناسایی ژن 16 SrRNA    49
جدول 3-7: دستگاه های مورد استفاده و مدل آنها    49
جدول 3-8: غلظت مواد مورد استفاده در  PCR با پرایمرهایAlk    54
جدول 4-1: نامگذاری و معرفی نقاط نمونه گیری بر حسب مشخصات جغرافیایی    57
جدول 4-2: نتایج شمارش باکتریهای هتروتروف    59
جدول 4-3: نتایج شمارش کل باکتری های تجزیه کننده    60
جدول 4-4: نتایج میزان جذب نوری نمونه‌های تجزیه‌کننده فنل در طول موج 600 نانومتر    64
جدول 4-5: نتایج میزان جذب نوری نمونه‌های تجزیه‌کننده نفتالین در طول موج 600 نانومتر    65
جدول 4-6: نتایج تست E24 برای نمونه‌های تجزیهکننده نفتالین    68
جدول 4-7: نتایج تست E24 برای نمونه‌های تجزیه‌کننده فنل    70
جدول 4-8: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف نفتالین    72
جدول 4-9: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف فنل    74
جدول 4-10: برنامه رسم درخت فیلوژنی سویه ها    92
جدول 4-11: برنامه رسم جدول فاصله های ژنتیکی سویه ها    94
جدول 4-12: فاصله ژنتیکی سویه ها    94

 
فهرست نمودارها
عنوان                                                  شماره صفحه
نمودار 2-1: مسیر تجزیه میکروبی فنل    36
نمودار 2-2: مسیر تجزیه میکروبی نفتالین    39
نمودار 4-1: درصد حذف فنل توسط سویههای تجزیهکننده این ترکیب    73
نمودار 4-2: درصد حذف فنل توسط سویههای تجزیهکننده این ترکیب    74
 
فهرست شکل ها
عنوان                                                 شماره صفحه
شکل 2-1: فرمول ککوله حلقه بنزن    21
شکل 2-2: فرمول ساختاری بنزن    21
شکل 2-3: نمایش موقعیت جانشینی روی حلقه دی متیل بنزن    21
شکل 2-4: برخی از آروماتیک های چند هسته ای فشرده    22
شکل 2-5: فرمول تترالین یا تتراهیدرونفتالن    22
شکل 2-6: مکانیسم های بروز سرطان    26
شکل 2-7: فرمول ساختاری فنل    28
شکل 4-1: پوشش کارشناس و نحوه قرار گیری صحیح در حین انجام کار با ترکیبات آروماتیک زیر هود    62
شکل 4-2: نمونه‌های کشت داده شده در محیط اختصاصی به اضافه فنل و نفتالین    63
شکل 4-3: نتایج تست E24 فعالیت امولسیون کنندگی    67
شکل 4-4: فاز آلی و آبی تفکیک شده در دکانتور, فاز آلی در قسمت بالا شامل هگزان و نفتالین و فاز آبی در پایین شامل ترکیبات محیط کشت اختصاصی و باکتری می باشد.    71
شکل 4-5: بررسی محصول PCR بر روی ژل آگارز    75
شکل 4-6: درخت فیلوژنی نمونهها    92
شکل 4-7: درخت فیلوژنی نمونههای جداسازی شده با مشخص بودن نتایج BLAST    93



چکیده
ترکیبات آروماتیک, جز آلاینده‌های نفتی بوده که در ساختمان مولکولی آن‌ها حلقه‌های بنزنی بکار رفته و به لحاظ پایداری در محیط‌های آبی از اهمیت خاصی برخوردار هستند. از آنجا که این ترکیبات بعنوان آلاینده‌های مهم در فهرست سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا آمده‌اند و از طرفی که سال 2013 بعنوان سال جهانی حفاظت از محیط زیست نامگذاری شده است و در دهه‌های اخیر به دلایل مختلف آلودگی آب خلیج‌فارس بعنوان یک محیط بسته دریایی به این ترکیبات افزایش یافته است. هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک از نوار ساحلی استان بوشهر در خلیج‌فارس است. یکی از روش‌های کاهش آلاینده‌های مختلف, روش بیولوژیک و استفاده از میکروارگانیسم ها جهت پاکسازی این‌گونه آلاینده‌ها است. در این مطالعه تعداد 25 نمونه آب, 6 نمونه خاک و 4 آب و خاک از نقاط مختلف با پراکنش مشخص از نوار ساحلی استان بوشهر جمع آوری گردید نمونه‌ها به محیط اختصاصی ONR7a منتقل شد, سپس در محیط نوترینت آگار کشت داده شده و بر باکتری‌های جدا شده تست‌های میزان رشد و فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و سنجش حذف برای بررسی میزان تجزیه فنل و نفتالین انجام شد. از باکتری‌های جدا شده جهت تشخیص مولکولی, جداسازی DNA انجام شد, سپس توسط پرایمر‌های Uni_1492R و Bac 27_F مورد PCR قرار گرفت و در نهایت تعداد 9 باکتری به عنوان تجزیه کننده فنل و نفتالین معرفی شدند. نتایج این تحقیق به وجود آلودگی به فنل و نفتالین در نوار ساحلی استان بوشهر و تفکیک منطقه‌ای هر باکتری انجامید. سپس با توجه به رسم درخت فیلوژنی و بررسی فاصله بین نمونه‌ها از صحت نتایج اطمینان حاصل شد.

کلمات کلیدی: تجزیه میکروبی, ترکیبات آروماتیک, منطقه ساحلی استان بوشهر, خلیج‌فارس, واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR).


فصل اول:
کلیات تحقیق

1-1- مقدمه
خلیجفارس به دلیل شرایط اقلیمی ویژهی حاکم بر آن بسیار شکننده و آسیبپذیر است و ورود کمترین آلایندهها به داخل دریا اثرات مخربی بر سلامت آبزیان و موجودات آن دارد. خلیجفارس با تمام مشکلات محیطی و اقلیمی که بر آن حاکم است از تنوع ژنی بالایی برخوردار است. از طرفی خلیجفارس محل حمل و نقل جهانی محسوب میشود و این امر موجب شده در سالهای گذشته لکههای نفتی بسیاری از این نفتکشها در آبهای خلیجفارس به جا بماند, از طرفی آلایندههای صنایع حاشیه سواحل وارد آب این دریا         میشوند و همچنین بخشی از آلایندهها بر اثر حرکت نفتکشها و شناورها, رها کردن آب توازن کشتیها- حفاری و عملیات کشف نفت- تراوش و استخراج نفت و ریختن زبالهها از داخل شناورها به خلیجفارس تزریق میشوند. مرجانهای زیبا و گونههای نادر گیاهی و جانوری در حالی قربانی توسعه بی رویه غیر اصولی و هجوم انواع آلایندهها به درون دریا میشوند که هنوز سازمان حفاظت از محیط زیست به عنوان دستگاه متولی حفظ محیط زیست نتوانسته اقدام موثر و شایستهای در این زمینه انجام دهد. که در نهایت اینگونه بیتوجهیها منجر به مرگ و میر آبزیان و مهاجرت آنها به خارج از منطقه, تغییرات در تنوع زیستی و کاهش تنوع زیستی و تغییر رفتار موجودات در محیط زیست منطقه میشود که از جمله آثار ناشی از آن آلودگی دریاهاست.
بخش اعظم آلایندههای موجود در خلیجفارس از نوع نفتی است, از طرفی نفت از میلیونها ترکیب تشکیل شده است که در کل میتوان آنها را در 4 دسته تقسیمبندی کرد که عبارتند از ترکیبات آروماتیک, هیدروکربنهای اشباع, رزینها و آسفالتنها. از طرفی ترکیبات آروماتیک با توجه به تعداد حلقههای بنزنی به کار رفته در ساختارشان تقسیمبندی میشوند که در این پروژه از فنل بعنوان یک ترکیب آروماتیک تک حلقه و از نفتالین بعنوان یک ترکیب دو حلقه استفاده شده است. ترکیبات آروماتیک از طریق استنشاق, بلعیدن و تماس مستقیم با پوست قابلیت ورود به بدن داشته و در صورت بروز این رخداد منجر به بروز علایمی چون استفراغ, سرگیجه و اسهال می‌شود و با توجه به خصوصیات شیمیایی که دارا می‌باشند, توانایی ایجاد جهش در ژنوم موجودات زنده را دارند و می‌تواند منجر به بروز سرطان در موجود زنده شوند. در این پروژه با بررسی آلودگی منطقه ساحلی استان بوشهر به ترکیبات آروماتیک موفق به جداسازی و شناسایی 9 سویه تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک شده و با رسم درخت فیلوژنی به بررسی جد مشترک میکروارگانیسم‌ها پرداخته‌ایم. بطور کلی این پایان ‌نامه از 5 فصل تشکیل شده است که عبارتند از فصل اول شامل کلیه قسمت‌های مربوط به پروپوزال جهت بیان مسئله و ارائه ضروریات اجرایی شدن مسئله و اهداف پروژه. فصل دوم مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق. فصل سوم شامل روش اجرای تحقیق می‌باشد.در فصل چهارم به تجزیه و تحلیل داده‌ها پرداخته ودر نهایت در فصل پایانی به بحث و نتیجه‌گیری و بیان پیشنهادات می‌پردازیم.

1-2- بیان مسئله
تجزیه زیستی مواد، به فرایندی اطلاق می‌شود که در طی آن مواد آلوده‌کننده خارجی به وسیله میکروارگانیسم‌هایی که قادرند از آنها استفاده کنند، به مواد بی‌ضرر تبدیل می‌شوند (Luis and Mara et al 2000, 69-75; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496). که در آن از میکروب‌های مختلف استفاده می‌شود و اساس کار آن استفاده از جمعیت‌های میکروبی به منظور تجزیه آلاینده‌ها بوده بنابراین ضرورت نظافت زیستگاه‌های طبیعی جمعیت‌های میکروبی قبل از هر کار دیگر لازم و ضروری می‌باشد (Aitken and Stringfellow et al 1998, 743-752). آلودگی نفتی از معضلات زیست محیطی می‌باشد، هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46) نفت‌خام کمپلکس پیچیده‌ای از مخلوط صد‌ها نوع ترکیب مختلف شامل هیدروکربن‌ها, نیتروژن, گوگرد و وانادیوم است که قسمت هیدروکربن شامل ترکیبات آروماتیک, آلیفاتیک و آسفالتی است (Sisler and Zobell 1987, 521-522; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496; Feijoo-Siota and Rosa-Dos- Santos 2008, 185-192) ورود هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای PAHs  به محیط زیست, اثرات بسیار خطرناکی در زندگی انسان خواهد داشت. مشخص شده است که PAH ها عوامل بالقوه سرطان‌زا برای انسان می‌باشند و به سرعت وارد بدن شده و در بافت‌های چربی بدن ذخیره می‌شوند (Koch and Fuchs 1992, 649-671). هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46). این آلاینده‌ها یکی از مهمترین آلودگی‌های زیست محیطی دنیا محسوب می‌شود که در اثر دفع و دور ریز نامناسب فاضلاب‌ها، ضایعات، پساب صنعتی و پخش آلاینده‌ها توسط نیروگاه‌ها و نشت آلاینده‌ها از مخازن نفت و ایستگاه سوختگیری و غیره وارد محیط زیست می‌شوند ((Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46; Cappello and Crisari et al. 2012, 39-50). استفاده از فعالیت‌های بیولوژیکی محیطی (باکتری‌های تجزیه کننده) در جهت حذف هیدرو‌کربن‌های نفتی که در این تحقیق ترکیبات آروماتیک می‌باشد نسبت به روش‌های فیزیکی (سوزاندن) که آلودگی زیست محیطی ایجاد می‌کند و روش شیمیایی (سورفکتانت‌ها) که روشی پر‌هزینه و دارای محدودیت می‌باشد مزیتی قابل توجه‌ای دارد (MacGillirray and Shiaris et al 1999, 90-101; Vinas and Grifoll et al 2002, 252-261; Moslemi and Vosoughi et al 2005, 15-23). میزان تجزیه و معدنی شدن ترکیبات آلی وابسته به غلظت ترکیبات است بطوریکه غلظت بالای هیدروکربن‌ها با محدود کردن مواد غذایی و اکسیژن یا از طریق اثرات سمی ایجاد شده بوسیله هیدروکربن‌های فرار از تجزیه زیستی ممانعت می‌کند. رشد میکرواورگانیسم‌ها روی هیدروکربن‌ها اغلب همراه با امولسیونه کردن منابع کربن نامحلول در محیط کشت است. در اغلب موارد این همراه با تولید عوامل امولسیونه کننده خارج سلولی در طی شکست هیدروکربن‌ها می‌باشد این فرآیند رشد میکرواورگانیسم روی نفت خام و متابولیزه کردن آن را امکان‌پذیر می‌سازد (حسن شاهیان و همکاران 1387، 8-1؛ طلایی و همکاران 1388، 68-57؛ طلایی و همکاران 1389، 68-80). در این تحقیق هدف بر این است که با جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک در اکوسیستم ایران و بکارگیری آنها به روش تجزیه زیستی موجبات کاهش این آلاینده‌ها فراهم گردد.

1-3- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق
رشد روز افزون فعالیت‌های صنعتی از یک سو و عدم رعایت الزامات زیست‌ محیطی از سوی دیگر که باعث افزایش آلاینده‌ها زیست‌محیطی در چند دهه اخیر شده، ضرورت جلوگیری و ایجاد روش‌های بهینه‌تر و اقتصادی‌تر برای از بین بردن این آلودگی‌های محیطی بیش از پیش قابل توجه است. هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که بر‌اساس فعالیت‌های مختلف در محیط‌ زیست تجمع می‌یابند. هیدروکربن‌های نفتی آلاینده‌های اصلی محیط‌های دریایی هستند. خلیج فارس از متنوع‌ترین اکوسیستم‌های جهان است. در آب‌های این منطقه 57.1% آلودگی نفتی مربوط به حمل و نقل کشتی‌ها و 22.4% مربوط به بهره‌برداری از دریا است. آلودگی مزمن محیط با نفت منجر به بهم ریختگی اکولوژِیکی و مانع از استفاده پایدار آن توسط بشر می‌شود (R and J 2003, 1234-1243). مهم‌ترین روش‌های حذف این آلودگی‌ها جداسازی فیزیکی، جذب، ژل‌سازی، امولسیون‌سازی و تصفیه‌زیستی می‌باشد اغلب این روش‌ها بر‌اساس جابجا کردن، پخش نمودن و انتقال آلودگی‌ها بوده و باعث حذف کامل آلاینده‌ها نمی‌شوند(حسن شاهیان و همکاران 1387، 8-1؛ طلایی و همکاران 1388، 68-57؛ طلایی و همکاران 1389، 68-80). تجزیه‌زیستی مشتقات نفتی در محیط‌های آلوده موثر‌تر, قوی‌تر و از نظر اقتصادی مقرون به‌صرفه‌تر از روش‌های فیزیک و شیمیایی است (Fedorak and Westlake 1981, 367-375). هیدروکربن‌های آروماتیک پلی‌سیکلیک (PAH) از دو یا چند حلقه شش عضوی تشکیل شده‌اند که این حلقه‌ها توسط اشتراک یک جفت اتم‌های کربن بین حلقه‌ها جوش‌خورده و بهم متصل شده‌اند و ساده‌ترین عضو این گروه نفتالین (C10H8) است (Zaidi and Imam 1999, 737-742) تا کنون 16 ترکیب PAH در فهرست سازمان حفاظت محیط زیست آمریکا, بعنوان آلاینده‌های مهم آمده است. از مهمترین آنها میتوان به نفتالین, آنتراسین, فنانترن, فلورن, کریزن, فلورانتن, پیرن, مشتقات آنها اشاره کرد (R and J 2003, 1234-1243) بازیافت، تصفیه و دفع این مواد شیمیایی سمی اهمیت زیادی دارد و در حال حاضر تصفیه ‌زیستی، یکی از فناوری‌های اصلی برای رفع آلودگی زیست محیطی به شمار می‌رود. روش‌های بیولوژیکی علاوه بر اینکه کم هزینه‌تر و موثرتر می‌باشد، سازگاری بیشتری نیز با محیط زیست دارند. تحقیقات بر روی تجزیه‌زیستی ترکیبات نفتی نشان داده است که این روش بهترین و موثرترین روشهای حذف ترکیبات نفتی از محیط زیست (خاکی و آبی) می‌باشد(حسن شاهیان و همکاران 1387، 8-1؛ طلایی و همکاران 1388، 68-57؛ طلایی و همکاران 1389، 68-80).

1-4- ادبیات تحقیق
برخی از تحقیقات انجام شده در زمینه جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک عبارتند‌از:
Sisler و همکاران در سال 1987 با استفاده از Pseudomonas fluorescens در تحقیق خود در تجزیه بیولوژیکی خاک‌های آلوده نفتی دریافتند که این سوش قادر است n آلکان‌های زنجیره کوتاه و بلند و همچنین تعدادی از هیدروکربن‌های آلیفاتیک و آروماتیک را تجزیه و تخریب کند (Sisler and Zobell 1987, 521-522), یکسال بعد یعنی 1988 Vales-Garcia و همکاران سویه‌ی جدیدی از Pseudomonas که توانایی تجزیه نفتالین دارد را جداسازی کردند (García-González and Govantes et al 2003, 7). پس از آن در سال 1989, Cerniglia و همکاران متابولیسم ترکیبات آروماتیک چند حلقه‌ای را در محیط‌های آبی بررسی کردند (Heitkamp and Cerniglia 1989, 1989-1994), سپس Folsom و همکاران در سال 1990 تاثیر Pseudomonas cepacia را بر تجزیه فنل بررسی کرد (Folsom and Chapman et al 1990, 1279-1285). بررسی اثر سویه‌های  Alcaligenesبر تجزیه‌زیستی ترکیبات آروماتیک همچون نفتالین, فنانترن یا پیرن توسطWeissenfels  و همکاران در سال 1990انجام شد (Weissenfels and Beyer et al 1990, 6). پس‌از آن Grifoll و همکاران در سال 1992 باکتری‌های تجزیه کننده فلورن را جداسازی و شناسایی کردند (Boldrin and Tiehm et al 1993, 1927-1930) و یکسال بعد Boldrin و همکاران در سال 1993 سویه‌هایی از باکتری Mycobacterium با توانایی تجزیه فنانترن را جداسازی کردند (Boldrin and Tiehm et al 1993, 1927-1930). جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Powlowski و همکاران در سال 1994 انجام شد (Powlowski and Shingler et al 1994, 219-236).  MacGillivray and Shiaris در همان سال چند میکروارگانیسم تجزیه کننده نفتالین شاملAlcaligenes denitrificans, Mycobacterium sp., Rhodococcus sp., Corynebacterium venale, Bacillus cereus, Moraxella sp., Streptomyces sp. را جداسازی کردند (Macgilliray and Shiaris 1994, 1154-1159) پس ‌از آن طی تحقیقی Ahmed در سال 1995 تاثیر Pseudomonas aeruginosa را برتجزیه فنل بررسی کرد (Ahmeda and Nakhlaa et al 1995, 99-107). Kirk و همکاران در سال  1997تاثیر Ochromonas danica رابر تجزیه فنل بررسی کردند (Kirk and Ronald 1997, 133-139).
بررسی اثر Phanerochaet chrysosporium تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Perez و همکاران در سال  1997انجام شد (Perez and Benito et al 1997, 207-213), سپس اثر Rhodococcus spp بر تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Margesin و همکاران در سال  1997سنجیده شد (Margesin and Schinner 1997, 462-468) و پس‌از آن در همان سالAlcaligenes xylosoxidans Y234  بعنوان تجزیه کننده فنل توسطSung Ho  وهمکاران معرفی شد (Sung Ho and Seung Ho et al 1997, 37-40) و نیز Arthobacter species بعنوان تجزیه کننده فنل توسط S.Kar و همکاران در سال مشابه معرفی گردید (Kar, Swaminathan et al. 1997). Bandhyopadhyay و همکاران در سال 1998 تاثیر Pseudomonas putida بر تجزیه فنل را بررسی کردند (Bandyopadhyay and Das et al 1998, 373-377). از طرفی Aitken و همکاران نیز در سال 1998 مشاهده کردند که Bacillus cereus در حضور نفتالین رشد میکند (Aitken and Stringfellow et al 1998, 743-752) در سال 2000 Kazunga و Aitken اعلام کردن که Sphingomonas yanoikayae R10 و Pseudomonas stutzeri P16و Pseudomonas stutzeri P15 و Bacillus cereus R1  توانایی تجزیه پیرن را دارا می‌باشند (Kazunga and Aitken 2000, 1917-1922.). Eduardo و همکاران در سال 2000 باکتری Alcaligenes faecali و مخمر Candida tropica را که قادر به تجزیه فنل بودند را گزارش کردند (Eduardo and Bastos et al 2000, 346-352) اثرNeptunomonas  و Stenotrophomona بر تجزیه ‌زیستی ترکیبات آروماتیک در سال 2000 توسط Ho و همکاران بررسی گردید (Ho and Jackson et al  2000, 100-112) یکسال بعد جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Gonzales و همکاران در سال 2001 به انجام رسید (Gonzalez et al 2001, 137-142) از طرفی Santos و همکاران در سال 2001 تاثیر Trichosporon species LE3 را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Santos and Heilbuth et al 2001, 171-178). Aleksieva و همکاران نیز در سال 2002 تاثیر Trichosporon cutaneumR57 را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Aleksieva et al 2002, 1215-1219). در همان سال Begona و همکاران در سال 2002 تاثیر Rhodococcus erythropolis UPV-1 را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Begoña Prieto et al 2002, 1-11). اثر Cycloclasticus بر تجزیه ‌زیستی ترکیبات آروماتیک در سال 2002 توسط Kasai و همکاران بررسی گردید (Kasai et al 2002, 5625-5633). بررسی اثر سویه‌های Rhodococcus, Aeromonas, Corynebacterium, Micrococcus  بر تجزیه ‌زیستی ترکیبات آروماتیک همچون نفتالین, فنانترن یا پیرن توسطSamante  و همکاران در سال 2002 انجام شد (Samanta et al 2002, 243-248).

پایان نامه جداسازی و تهیه تک کلون های القاء کننده پرحساسیتی دیررسDTH) ) از لیشمانیا ماژور و ارزیابی آن ها

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه جداسازی و تهیه تک کلون های القاء کننده پرحساسیتی دیررسDTH) ) از لیشمانیا ماژور و ارزیابی آن ها دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:119

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((.M.Sc)) زیست شناسی
گرایش: علوم سلولی و مولکولی

عنوان: جداسازی و تهیه تک کلون های القاء کننده پرحساسیتی دیررسDTH) ) از لیشمانیا ماژور و ارزیابی آن ها به صورت in vitro و invivo در مقایسه با لیشمانین

فهرست مطالب:
عنوان                                                                                                                           صفحه
خلاصه فارسی    1
مقدمه     3
فصل اول: کلیات
1-1 تعریف بیماری لیشمانیوز    6
1-1-2 تاریخچه لیشمانیوز در جهان    7
1-1-3 تاریخچه لیشمانیوز در ایران    8
1-2 رده¬بندی و طبقه¬بندی انگل لیشمانیا    9
1-3 مورفولوژی و سیر تکاملی انگل لیشمانیا    11
1-3-1-1 مورفولوژی انگل    11
1-3-1-2 شکل بی تاژک (آماستیگوت یا جسم لیشمن)    11
1-3-1-3 شکل تاژک دار (پروماستیگوت)    12
1-3-2-1 سیر تکاملی انگل    15
1-3-2-2 سیر تکاملی انگل در بدن حشره    15
1-3-2-3 پشه خاکی    15
1-3-2-4 سیر تکاملی انگل در بدن میزبان مهره دار    16
1-4  راههای انتقال لیشمانیا به انسان    18
1-4-1 انتقال از طریق نیش پشه خاکی    19
1-4-2  انتقال مکانیکی    19
1-4-3 انتقال از راه خون    19
1-4-4 انتقال مستقیم    19
1-5 بیماری¬زایی لیشمانیا    20
1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا    19
1-5-2 لیشمانیوز احشایی    20
1-5-3  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)    21
1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن    22
1-5-3-2  لیشمانیوز جلدی خشک    22
1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب    22
1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)    23
1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)    24
1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی    24
1-6 ایمنولوژی عفونت¬های لیشمانیا    25
1-6-1  مشخصات ایمنولوژیکی در لیشمانیوز پوستی    25
1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال    25
1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی    26
1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماکروفاژ در لیشمانیوز    26
1-6-1-3  عملکرد T-CELL    27
1-6-2  مشخصات ایمنولوژیکی در لیشمانیوز احشایی    28
1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در کالاآزار    28
1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در کالاآزار    28
1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD+4    29
1-7  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز    30
1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل    30
1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده    31
1-7-1-1 رنگ آمیزی    31
1-7-1-2 کشت انگل    32
1-7-2  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل    32
1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال    32
1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی    33
1-7-2-2-1 تستهای پوستی    33
1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)    34
1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو    35
1-7-3-1 معرف آنتی¬ژنی لیشمانین برای تست پوستی    35
1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T)     37
فصل دوم : مروری بر متون گذشته
فصل سوم: مواد و روشها
3-1کشت انگل    43
3 -1-1  مواد مورد نیاز جهت کشت انگل    43
3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت کشت انگل    43
3-1-3. طرز تهیه محیط کشت مایع RPMI- 1640    44
3-1-4. طرز تهیه محیط کشت کامل    44
3-1-5. طرز تهیه محیط کشت NNN    44
3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline    45
3-1-7. روش کشت انگل    45
3-1-8. روش شمارش سلولها    46
3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل    46
3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار    46
3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay    47
3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay    48
3-2-2. مراحل Limiting dilution assay    48
3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی    50
3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو    50
3-4 تهیه آنتی¬ژن Freeze - thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی¬ژن¬ها    52
3-5 الکتروفورز آنتی¬ژن¬های پروتئینی در ژل پلی¬آکریل¬آمید ( SDS-PAGE )    53
3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی¬آکریل¬آمید    53
3-5-2 سیستم بافری    54
3-5-3  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE    54
3-5-4 آماده¬سازی نمونه    57
3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود    57
3-5-7. روش انجام SDS-PAGE    58
3-5-8 روش رنگ¬آمیزی با کوماسی آبی R- 250    59
مواد مورد نیاز رنگ¬آمیزی کوماسی آبی R- 250:     59
3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay    60
3-6-1 مواد و معرف¬های مورد نیاز تست Bradford    60
3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام    61
3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)    62
3-7-1 روش انجام تست L.T.T    63
1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T    64
3-8 ایمنی¬زایی در خوکچه هندی    66
3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی¬زایی در خوکچه هندی    67
3-8-2  نحوه ایمنی¬زایی در خوکچه    67
3-9 تزریق داخل پوستی آنتی¬ژن¬ها و سنجش میزانDTH    69
3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH    69
3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی    69
3-9-3  نحوه سنجش میزان DTH    70
فصل چهارم: نتایج
4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون¬ها با روش limiting dilution    72
4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون¬ها    72
4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی¬ژن¬ها به روش Bradford    73
4-4 بررسی نتایج تست L.T.T    74
4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی¬ژن B    74
4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی¬ژن C    75
4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی¬ژن D    76
4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی¬ژن لیشمانین استاندارد (M)     76
4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی¬ژن¬ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A    77
4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T    79
4-5 بررسی نتایج تست¬های DTH بر روی خوکچه¬های هندی    79
4-5-1  نتایج تست DTH 24 ساعته    79
4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته    82
4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته    83
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
منابع    95
خلاصه انگلیسی    106
 
فهرست اشکال و جداول و نمودارها
عنوان                                                                                                                           صفحه
شکل 1-1. اشکال مختلف انگل های لیشمانیا     11
شکل1-2. پروماستیگوت لیشمانیا (خارج سلولی)     14
شکل -1-3. اشکال اماستیگوت و پروماستیگوت     15
شکل 1-4. پشه خاکی     17
شکل1-5. چرخه زندگی لیشمانیا در میزبان مهره دار     18
شکل 1-6.. اشکال مختلف لیشمانیوز جلدی (سالک)     24
شکل 1-7. بلعیده شدن پروماستیگوت لیشمانیا توسط یک سلول ماکروفاژی     28
شکل3-1. شکل شماتیک لام نئوبار     48
جدول3-1. جدول تهیه  ژل جدا کننده پایین SDS-PAGE     56
جدول3-1. جدول تهیه  ژل جدا کننده بالا SDS-PAGE     57
جدول3-1. جدول تنظیم رقت دستگاه spect     62
شکل 4-1. پروفایل پروتئینی باندهای حاصل از تک¬کلون¬ها در مقایسه با نمونه لیشمانین استاندارد    74
جدول 4-1. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی¬ژنB     75
جدول 4-2. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی¬ژن C    76
جدول 4-3. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی¬ژنی D    77
جدول 4-4. نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی¬ژنیM    78
جدول 4-5. مقایسه نتایج اندکس تحریکی به دست آمده در حضور نمونه¬های آنتی¬ژنی تک کلونی
و Con-A    79
نمودار1-4. نتایج میانگین اندکس تحریکی هر یک از تک کلون¬ها در تست L.T.T    80
جدول4-6.  میانگین تست¬های DTH ،24 ساعته    81
  نمودار 2-4. بررسی نتایج تست¬های داخل پوستی پس از 24 ساعت     81
جدول4-7.  میانگین تست¬های DTH ، 48 ساعته     82
  نمودار 4-3. بررسی نتایج تست¬های داخل پوستی پس از 48 ساعت     82
جدول4-8.  میانگین تست¬های DTH ،72ساعته     83
نمودار 4-4. بررسی نتایج تست¬های داخل پوستی پس از 72 ساعت     83


 
 
خلاصه فارسی

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت¬های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم¬های گسترش یافته غیر بهبود شونده می¬باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می¬کند. واکنش-های حساسیت شدید دیررس که با تست¬های پوستی لیشمانین تشخیص داده می¬شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی¬ژن¬های لیشمانیایی، سنجش واکسن¬های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می¬شود، که نیازمند یک آنتی¬ژن استاندارد خالص و هموژن می¬باشد.
هدف: تهیه و سنجش تک¬کلون¬های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست¬ پوستی
روش: جداسازی تک¬کلون¬ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR//ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون¬های جداشده با استفاده از روش¬های برون¬تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول¬های تک¬هسته¬ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک¬کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک¬کلون¬های جداشده به¬همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان¬ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.
 
نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک¬کلون¬ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک¬کلون¬ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/271/8، 65/271/8، 13/243/8 به ترتیب) قابل مقایسه¬ای با لیشمانین ( 512/310) نشان دادند. سنجش درون¬تنی تک¬کلون¬های جداشده، در خوکچه¬های هندی نشان داد که هر سه تک¬کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه¬های هندی تست شده با آنتی¬ژن C نشان داد.
یافته¬ها: اطلاعات نشان دادند که تک¬کلون¬های جداشده توانایی القاء واکنش¬های درون¬تنی و برون¬تنی قابل مقایسه¬ای با لیشمانین استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتی¬ژن خالص و هموژن را در تست¬های پوستی در مطالعات لیشمانیوزی را دارند
کلید واژه: ایمنی سلولی، لیشمانیا ماژور، لیشمانین، تست تکثیر لنفوسیتی، تست های پوستی


مقدمه
انگل لیشمانیا یک پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث ایجاد طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی ساده تا عفونت های احشایی شود که با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می¬شود(99).
به بیماری¬های حاصل از انگل های جنس لیشمانیا، لیشمانیازیس گفته می¬شود. این بیماری در 88 کشور در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان گسترش یافته است و اینک 12 میلیون نفر به این انگل مبتلا می باشند و350 میلیون نفر در خطر ابتلا به این بیماری قرار دارند. با وجود کوشش هایی که برای مبارزه با بیماری انجام شده، سالیانه 1 تا 2 میلیون مورد جدید جهانی گزارش می شود ، که 5/1 میلیون مورد از نوع جلدی و500هزار نفر از انواع احشایی می¬باشد. در انسان بیماری به سه فرم بالینی جلدی (CL) ، جلدی مخاطی (ML)  و احشایی (VL)  بروز می¬کند(57،83).
عفونتهای پارازیتی مثل لیشمانیوز می توانند در  بیماریهای ایمنوساپرس کننده مثلHIV پدیدار شود. عفونت توأم این بیماری¬ها با لیشمانیوز بعنوان یک تهدید جدی در کشورهایی است که هر دو عامل پاتوژنیک را دارند( 106).
سازمان بهداشت جهانی آن را  در زمره 8 بیماری مهم انگلی دنیا با شیوع بالا در جهان قرار داده است. کنترل این بیماری از اولویتهای سیستم بهداشتی و درمانی جهان است و نیز از اولویتهای تحقیقاتی انیستیتو پاستور ایران نیز می¬باشد(49).
افراد در تمام سنین در معرض ابتلا به این بیماری می باشند. بیش از %90 موارد ابتلا به لیشمانیای پوستی در کشورهای افغانستان، عراق، پرو، عربستان سعودی و متأسفانه ایران گزارش شده است( 47). این انگل امروزه بصورت انگلی فرصت طلب در افراد دچار نقص ایمنی درآمده است و به دلیل اینکه در ایران نیز موارد ابتلا به آن زیاد می باشد، لذا لازم است در زمینه شناخت بیشتر خود انگل و راه¬های مقابله با آن مطالعات وسیعتری صورت گیرد.



فصل اول

کلیات

تعریف بیماری لیشمانیوز
انگل پروتوزوای جنس لیشمانیا  یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث بروز طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی تا عفونت های احشایی شود. این انگل¬ها با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می¬شود( 47). این بیماری در نواحی روستایی و شهری بیشتر نقاط کشور وجود دارد. ناقل بیماری تنها یک سوم اندازه پشه معمولی است و به سختی با چشم دیده می شود. انسان در نوع شهری لیشمانیوز (سالک شهری) به عنوان میزبان اصلی محسوب می شود و به ندرت اتفاق می افتد که از مادر باردار به جنین یا با انتقال خون یا سوزن آلوده سرایت کند( 47).
این بیماری در انسان می تواند به اشکال مختلف بروز نماید و در مورد فرم احشایی در صورت عدم درمان حتی به مرگ منجر گردد(29،17). ژنوم این انگل در سال 2002 حدود 32 مگا باز ژنوم و8500 ژن تخمین زده شد که با ترجمه آنها بیشتر از 10000 پروتئین حاصل خواهد شد(16).
یکی از خصوصیات مهم انگل لیشمانیا، رشد و تکثیرآن در درون فاگولیزوزوم¬های ماکروفاژها است. تعداد کمی از میکروارگانسیم ها قادرند که تحت چنین شرایطی ودر مجاورت انواع آنزیم های هیدرولیتیک زندگی کنند. بنابراین مراحلی که منجر به ورود انگل به درون فاگولیزوزوم می¬گردد از اهمیت خاصی برخوردار است(77).
میزبان مهره دار برای انگل شامل میزبان پستاندار وخزنده است که میزبان پستاندار شامل انسان، سگ، سگ سانان و برخی جوندگان ودیگر جانوران وحشی می باشد. لیشمانیوزها عموما توسط گونه های پشه خاکی منتقل می شوند. ناقل این انگل ها در دنیای قدیم (همه قاره ها بجز آمریکا) پشه خاکی های متعلق به جنس فلوبوتوموس می باشد و در دنیای جدید گونه های مختلف پشه خاکی های ماده از جنس لوتزومیا
می¬باشد(20،92،69،101).
عامل بیماری¬زایی در لیشمانیوز، یعنی لیشمانیا، از راسته کینتوپلاست داران است که برحسب سیر تکاملی و محیط زیست خود به دو شکل بی تاژک یا آماستیگوت (یا جسم لیشمن) در درون سلولهای سیستم رتیکولواندوتلیال مهره داران مانند ماکروفاژها و شکل تاژکدار پروماستیگوت (یا لیپومونادی) در درون بدن پشه خاکی ناقل و محیط کشتهای مصنوعی مثل NNN  دیده می¬شود (3).
1-1-2 تاریخچه لیشمانیوز در جهان
کانینگهام  در سال 1885 در فرانسه ترشحات زخم پوستی بیماری را که به آن تاول دهلی می گفتند، مورد مطالعه قرار دارد. این محقق، ماکروفاژهای میزبان را انگل آمیبی پنداشته و اجسام داخل ماکروفاژها را هاگ (اسپور) تصور کرده بود(64). رایت اجسامی شبیه به آنچه کانینگهام گزارش داده بود در زخم پوستی دختری که از ارمنستان به بوستون مهاجرت کرده بود مشاهده کرد. او این انگل را هلیکوزوماتروپیکوم نامید و فکر می کرد که متعلق به گروه میکروسپوریدیا باشد(3و18). در سال 1900 لیشمان  در طحال سربازی که از تب دام دام  در هندوستان مرده بود اجسام بیضی شکلی را در داخل سلول های بزرگی مشاهده کرد (دام دام شهری است که بیماری لیشمانیوزاحشائی در آن دیده شده بود). لیشمان نتیجه مطالعات خود را در سال1903 منتشر ساخت.
در همین سال دونووان   در مدرسه هندوستان اجسامی شبیه به آن چه لیشمان در بیماری دام دام یافته بود در طحال بیمارانی که مبتلا به تب های نامرتب می¬شدند مشاهده کرد. امروزه به تب دام و سایر بیماری های شبیه به آن لیشمانیوز احشایی یا کالاآزار گفته می¬شود. راس  نیز در سال 1903 جنس لیشمانیا را معرفی کرد. لاوران ومسنیل در همان سال نام لیشمانیا دونووانی را به عنوان عامل بیماری کالا آزارپیشنهاد کردند. سپس تشابه شکل انگل زخم شرقی وعامل کالاآزار تایید گردید و لوهه در سال 1906 نام لیشمانیا تروپیکا را برای عامل زخم شرقی و یا سالک پیشنهاد کرد(53،95).  ونیون در سال 1911 خاطر نشان ساخت که فلبوتوم ممکن است ناقل بیماری های ناشی از لیشمانیا باشد. ولی 30 سال گذشت تا نظریه ونیون توسط آدلر  به اثبات رسید. این محققین نشان دادند که فلبوتوموس پاپاتاسی در حقیقت ناقل لیشمانیا تروپیکا به انسان است وسوامینات  و همکاران ملاحظه کردند که فلبوتوموس آرجنتیپس  ناقل لیشمانیا دونووانی است(86،87،93).