پایان نامه بررسی تاثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنین های حاصل از تخمک های منجمد شده (انجماد شیشه ای) گوسفند

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه بررسی تاثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنین های حاصل از تخمک های منجمد شده (انجماد شیشه ای) گوسفند دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:131

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد  ((M.Sc))
گرایش: سلولی-مولکولی

فهرست مطالب:
عنوان    صفحه
    خلاصه فارسی............................................................................................................................................................1
   فصل اول: کلیات
مقدمه ..........................................................................................................................................................................2
1-1-  بیان مسئله......................................................................................................................................................4
1- 2 -اهداف  پژوهش..............................................................................................................................................5
1-3-  ضروریت انجام تحقیق..................................................................................................................................6
1-4- تولید جنین در شرایط in vivo
1-4-1- روند ایجاد سلول جنسی ماده.......................................................................................................6
1-4-1-1- ویژگی¬های اووسیت ثانویه...................................................................................................................8
1-4-2- روند ایجاد سلول جنسی نر......................................................................................................................9
1-4-3- لقاح.............................................................................................................................................................10
1-4-4- تسهیم........................................................................................................................................................12
1-5- تولید جنین در شرایط in vitro
1-5-1- بلوغ آزمایشگاهی تخمک (IVM).......................................................................................................15
1-5-2- ظرفیت پذیری اسپرم..............................................................................................................................19
1-5-3- لقاح در شرایط آزمایشگاهی(IVF).....................................................................................................21
1-5-4-کشت جنین در شرایط آزمایشگاهی(IVC).......................................................................................23
1-6- مقایسه جنین¬های طبیعی با جنین¬های آزمایشگاهی............................................................................26
1-7- انجماد
1-7-1- مراحل اصلی انجماد................................................................................................................................30
1-7-2- راه¬های کاهش اثرات زیانبار مواد محافظت کننده.............................................................................30
1-7-3- روش¬های انجماد......................................................................................................................................30
1-7-3-1- انجماد شیشه-ای..................................................................................................................................31
1-7-3-1-1- عوامل تکنیکی موثر در انجماد شیشه-ای..................................................................................32
1-7-3-1-1-1- زمان تعادل و آبگیری..............................................................................................................32
1-7-3-1-1-2- سرعت سرد کردن....................................................................................................................32
1-7-3-1-1-3- سرعت گرم کردن.....................................................................................................................35
1-7-3-1-1-4- مواد محافظ انجمادی...............................................................................................................35
1-7-3-1-1-5- نقش ضد یخ-ها...........................................................................................................................36
1-7-3-1-1-6- ذوب و آبدهی............................................................................................................................. 36
1-8- آلدوسترون.......................................................................................................................................................37
1-8-1- خصوصیات.................................................................................................................................................37
1-8-2- عملکرد.......................................................................................................................................................38
1-9- ارزیابی کیفیت رویان....................................................................................................................................41
1-10- سلول¬های رویانی........................................................................................................................................43
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
2-1- اثرات انجماد بر روی تخمک.......................................................................................................................46
2-2- اثر روش انجماد شیشه-ای............................................................................................................................47
2-3- بیان زیر واحد¬های پمپ Na/K ATpase در تخمک و جنین.........................................................48
2-4- پمپ  Na/K ATpase ...........................................................................................................................49
2-5- آکواپورین-ها....................................................................................................................................................51
2-6- هچ یا تفریخ....................................................................................................................................................52
2-7- فعال شدن ژنوم رویانی................................................................................................................................55
2-8- متابولیسم رویان............................................................................................................................................56
2-9- نقش آلدوسترون در بیان پروتیین Na/K ATpase..........................................................................58
فصل سوم: مواد و روش¬ها
3-1- تولید جنین های حاصل از لقاح خارج رحمی (IVF)
3-1-1- جمع‌آوری تخمدان‌ها از کشتارگاه و استحصال تخمک‌ها از مایع فولیکولی.................................61
3-1-2- بلوغ آزمایشگاهی تخمک‌ها (IVM)………………..……....…….………………………………………..62
3-1-3- لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF)...........................................................................................................63
3-1-3-1- آماده سازی اووسیت¬های بالغ شده برای لقاح...............................................................................63
3-1-3-2- آماده سازی اسپرم..............................................................................................................................63
3-1-4- کشت داخل آزمایشگاهی جنین های حاصل از(IVF)...................................................................64
3-1-5- تازه کردن محیط کشت جنین‌ها..........................................................................................................65
3-2- تهیه محلول‌های انجمادی...........................................................................................................................65
3-3- مراحل انجام روند انجماد شیشه ای..........................................................................................................66
3-4- محیط ذوب.....................................................................................................................................................66
3-5- گروه¬های آزمایشی و طراحی مطالعه.........................................................................................................66
3-6- ارزیابی جنین‌ها
3-6-1- ارزیابی کیفی جنین‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی افتراقی...................................................................68
3-7- ایمونوسایتوشیمی پروتئین¬های سطحی جنین های گوسفندی(Sheep embryo ICC)........70
فصل چهارم: نتایج
4-1- تخمک¬های منجمد شده
4-1-1- گروه آزمایشی اول، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک¬های
منجمد-ذوب شده در مرحله GV.........................................................................................................................82
4-1-2- گروه آزمایشی دوم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم
جنینی (D4)، به محیط کشت جنین¬های حاصل از تخمک¬های منجمد-ذوب شده..................................82
4-1-3- گروه آزمایشی سوم، افزودن آلدوسترون در طی IVM،
ومتعاقباً انجماد تخمک ها در مرحله MII...........................................................................................................83
4-1-4- گروه آزمایشی چهارم، یا گروه کننرل..................................................................................................83
4-2- تخمک های منجمد نشده
4-2-1- گروه آزمایشی پنجم، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک¬های غیر منجمد...................85
4-2-2- گروه آزمایشی ششم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی (D4)، به محیط کشت جنین-های حاصل از تخمک¬های غیر منجمد................................................................................................................85
4-2-3- گروه آزمایشی هفتم، یا گروه کنترل....................................................................................................86
4-3-
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث.............................................................................................................................................................................89
نتیجه¬گیری    94
پیشنهادات    95
منابع    96
خلاصه انگلیسی..................................................................................................................................................113


فهرست جداول
عنوان    صفحه
جدول 3-1- ترکیبات محیط HEPES buffered M199    73
جدول 3-2- ترکیبات محیط Bicarbonate buffered M199    73
جدول 3-3- ترکیبات محیطIVF medium “Fert. TALP”    74
جدول 3-4- ترکیبات محیطRinsing medium “R. TALP”    74
جدول 3-5- ترکیبات محیط Sperm medium “S. TALP”    75
جدول 3-6- ترکیبات محیط H-SOF    75
جدول 3-7- ترکیبات محیطی IVC- SOF    76
جدول 3-8- Medium A    76
جدول 3-9- مواد شیمیایی و تجهیزات    77
جدول 4-1- حضور آلدوسترون در محیط کشت در زمانIVM  یا روز چهارم
 کشت جنینی، در تکامل جنین حاصل از تخمک های منجمد-ذوب شده......................................................83
جدول 4-2- حضور آلدوسترون در محیط کشت  در زمانIVM  یا روز چهارم
 کشت جنینی، در تکامل جنین حاصل از تخمک های تازه    86
جدول 4-3- حضور آلدوسترون در محیط کشت در زمانIVM  یا روز چهارم
کشت جنینی و تأثیر آن بر تعدا سلول های در تعدادی از سلول¬های بلاستوسیست در تقسیم جنین¬های حاصل از تخمک¬های تازه    86

                                                                                      
فهرست نمودارها
عنوان    صفحه
نمودار 4-1- تاثیر آلدسترون روی بیان زیرواحد های α1 و β1 پمپ  ATPase سدیم
 و پتاسیم در مدت IVM   یا  IVC – روز چهارم- در محیط کشت سلولهای
 بلاستوسیت. نوارها با حروف مختلف نشان دهنده تفاوت معنی¬دار می¬باشد    87


فهرست اشکال
عنوان    صفحه
شکل 1-1- روند انجام اووژنزیزیس و اسپرماتوژنزیس    10
شکل 1-2- روند انجام لقاح از زمان رشد تخمک    11
شکل 1-3- تصاویر شماتیک مراحل نفوذ اسپرم به داخل تخمک    21
شکل 1- 4- تصویر شماتیک روند تکامل جنین    24
شکل 1-5- دو مکانیسم عملکرد مولکولی آلدوسترون    38
شکل 1- 6- سیگنال های آلدوسترون    39
شکل 1-7- میزان اتصال سلول – سلول در توده سلولی رویان    44
شکل 2-1- اتصالات سلولی در رویان در حال تقسیم ونقش آنها در تشکیل حفره
 بلاستوسل و تعیین موقعیت سلول¬های ترفکتودرم و توده داخلی    50
شکل2-2- فرایند تشکیل حفره بلاستوسل    51
شکل2-3-  ساز وکار کنترل فرایند هچ شدن بلاستوسیست    53
شکل 2-4- پدیدۀ فعال شدن ژنوم رویانی    56
شکل 3-1- رنگ آمیزی افتراقی بلاستوسیت های مشتق از تخمک های منجمد    69
شکل 3-2- رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی زیر واحد های α1 و β1 پمپ Na+/K+ ATPase    72
شکل 4-1- تصاویر مورولا و بلاستوسیست تولید شده در آزمایشگاه
جنین شناسی پژوهشگاه ابن سینا    84
شکل 4-2- تصاویر بلاستوسیست های در حال تفریخ در آزمایشگاه
جنین شناسی پژوهشگاه ابن سینا    84

 
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تآثیر آلدوسترون در افزایش توانمندی تکاملی تخمک های منجمد شده گوسفند با افزودن آلدوسترون در مرحله بلوغ تخمک و مرحله کشت جنینی می باشد.
مواد و روش ها: تخمک های حاصل از تخمدان های کشتارگاهی، بطور تصادفی به شش گروه آزمایشی تقسیم شدند: گروه های یک و دو: بلوغ تخمک های (IVM) منجمد شده و تازه در حضور آلدسترون و متعاقباً لقاح آزمایشگاهی تخمک ها (IVF) و کشت جنین های حاصله (IVC) (به ترتیب گروه هایVit-IVM  و IVM). گروه های سه و چهار: IVM و IVF تخمک های منجمد شده و تازه، و متعاقباً IVC جنین های حاصله در حضور آلدوسترون در روز چهارم (D4) کشت جنینی (به ترتیب گروه های Vit-D4 و D4).  گروه های پنجم و ششم: IVM، IVF و IVC تخمک های منجمد شده ( Vit-Cont) و تازه (Fresh-Cont) بدون حضور آلدوسترون. جنین ها در مراحل مورولا و بلاستوسیت، توسط آنتی بادی های اولیه بر علیه زیر واحدهایα1  و β1 پمپ Na+/K+/ATPase رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی شدند.
نتایج: میزان تفریخ در گروه هایی که در IVM و یا IVC آنها آلدوسترون افزوده شده بود، در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه (به ترتیب گروه های Vit-IVM، IVM، Vit-D4 و D4) در مقایسه با گروه های کنترل (به ترتیب Vit-Cont. و Fresh-Cont.) به طور معنی داری بیشتر بود. میزان بیان تحت واحد β1 پمپ Na+/K+/ATPase، در گروه های Vit-D4 و D4 به طور معنی داری بیشتر از سایر گروه های بود. همچنین نسبت ICM/Total نیز به طور معنی داری در گروه IVM بیشتر از سایر گروه ها بود.
بحث: به طور خلاصه، اضافه نمودن آلدسترون به محیط های کشت IVM و IVC می تواند موجب افزایش معنی دار میزان تفریخ در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه گردد. این افزایش میزان تفریخ ممکن است با میزان بیان بیشتر زیر واحد β1 پمپ Na+/K+/ATPase، که احتمالاً توسط افزودن آلدوسترون به محیط کشت القا گردیده است، در ارتباط باشد.  
کلید واژه: آلدوسترون، گوسفند، جنین، تکامل، Na+/K+/ATPase، بیان


مقدمه و معرفی طرح
در سال¬های اخیرعلل مختلفی از قبیل بالا رفتن سن ازدواج، تعییر شیوه زندگی، عوامل عفونی و شیمیایی، اشعه و شیمی درمانی، مسائل ژنتیکی و یائسگی زود رس منجر به ناباروری زوج¬های بسیاری شده و لذا انجماد و نگهداری تخمک اقدام اساسی در حفظ قدرت باروری و درمان ناباروری به شمار می¬رود. با توجه به ضرورت حفظ و نگهداری تخمک در روش¬های کمک باروری (ART) تلاش¬های زیادی جهت انجماد و نگهداری تخمک¬ها صورت گرفته است، لیکن تا¬کنون روش قابل اعتمادی در انجماد تخمک که بتواند میزان بالایی از زنده مانی تخمک¬ها را نشان دهد گزارش نشده است. علی رغم بررسی های متعدد صورت گرفته بر روی تغییرات مورفولوژیک، فراساختاری، فیزیولوژیک و عملکردی تخمک های منجمد- ذوب شده، هنوز اطلاعات اندکی در خصوص وقوع تغییرات ملکولی و بیوشیمیایی ¬ایجاد شده در تخمک های مذکور و نیز الگوی بیان پروتیین های مرتبط با توان تکاملی تخمک ها پس از لقاح، به چشم می خورد. با توجه به مطرح بودن این گونه حیوانی به عنوان حیوان مدل انسان برای مطالعات تخمدان و تخمک، خطر انقراض برخی از نژادهای این گونه جانوری، اهمیت این گونه حیوانی از نظر اقتصادی (فراورده های دامی)، نقش آن به عنوان بیوراکتور در مطالعات مرتبط با تولید حیوان تراریخته و نیز عدم انجام مطالعه ای در خصوص بررسی ارتباط بین تجویز آلدوسترون و وضعیت بیان آنزیم Na+/K+/ATPase در روند تشکیل بلاستوسیست، در مطالعه حاضر به بررسی تاثیرآلدوسترون در بهبود کیفی تخمک های منجمد شده پرداخته خواهد شد.  
بدین منظور تخمک های استحصال شده از تخمدان های کشتارگاهی گوسفند، در مرحله GV از تقسیمات میوزی به روش کرایوتاپ و با استفاده از روش انجماد شیشه ای منجمد و پس از گذشت یک هفته ذوب شده و پس از لقاح، مراحل تکاملی آنها در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار می گیرد.