شیوه سخنرانی موثر و فن بیان

اختصاصی از کوشا فایل شیوه سخنرانی موثر و فن بیان دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

نام کتاب :  شیوه سخنرانی مؤثر و فن بیان

نویسنده : ایرج هاشمی

زبان کتاب :  پارسی

تعداد صفحه : 26

قالب کتاب : PDF  

حجم فایل :  197  Kb

توضیحات :  اعتراف هزاران نفر درباره سخنرانی چنین بوده است : موقعی که از من خواسته می شود سخنرانی کنم چنان دست و پایم را گم می کنم و دچار ترس می شوم که قادر نیستم درست فکر کنم، درست حواسم را جمع کنم و درست به یاد بیاورم که میخواستم چه بگویم. من می خواهم اعتماد به نفس داشته باشم و بتوانم در حالی که جلوی جمع ایستاده ام، فکر کنم. می خواهم افکارم نظم منطقی داشته باشد و می خواهم حرف هایم را خیلی روشن و به طریقی که افراد را کاملاً متقاعد کند، در جلو جمع بیان کنم. شما خود را در این باره چگونه ارزیابی می کنید. آیا مایلید که این هنر را در خود ایجاد کنید یا توسعه دهید؟ آیا مایلید ضعفهای احتمالی خود را در این مورد کشف و برطرف نمایید ؟ اگر چنین است این نوشتار به همین منظور تدارک دیده شده و شما را در این امر یاری خواهد داد.

پایان نامه سیم برش الماسه و تعیین قطر بیرونی سیم برش و بیان استاندارد ASTM

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه سیم برش الماسه و تعیین قطر بیرونی سیم برش و بیان استاندارد ASTM دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت:word(قابل ویرایش)

تعداد صفحات:49

چکیده

 یکی ازپارامتر های مهم در انتخاب ابزار مناسب برش تخته سنگ ، شناخت نوع سنگ قابل برش و خواص فیزیکی و مکانیکی آن می باشد. در این راستا خواص مذکور بایستی با معیار های استاندارد ASTM مطابقت داشته تا پس از برش ، ارزش اقتصادی داشته و متناسب با آن خصوصیات ، بتوان ابزار مناسب برش را انتخاب نمود. یکی از ابزار های مهم مورد استفاده در برش تخته سنگ ، سیم برش الماسه می باشد.استفاده از این تکنولوژی در اکثر معادن جهان توسعه پیدا کرده و امتیازات ویژه ای نسبت به دیگر تکنیک های برش تخته سنگ دارد. این تکنولوژی شامل وارد کردن متالوژی ساییدن و چکش خواری همراه با چرخش می باشد . در این مطالعه سعی شده است که علاوه بر آشنایی با روش های مختلف برش تخته سنگ ، ترکیب سیم های مرکب الماسه دار و کابل های با مقاومت بالای ترکیب یافته از مس و نبوبیم و اندازه قطر بهینه سیم برش ، مورد بحث قرار گیرد.

• فهرست
  عنوان صفحه
  تقدیر و تشکر 1
  چکیده: 2
  مقدمه : 3
  فصل اول: 4
  آشنایی با روشهای مختلف استخراج سنگ 4
  1-1ـ مقدمه : 5
  1ـ2ـ روش استخراج با چال های موازی : 6
  1-3- استخراج بلوک به کمک پارس و گوه : 7
  1ـ4 ـ استخراج بلوک به شیوه مکانیکی : 7
  1 ـ 5 ـ استخراج به کمک مواد ناریه سبک : 8
  1 ـ 6 ـ استخراج با ماشین های شیارزن ( هاواژ ) : 8
  1 ـ 6 ـ 1 ـ ماشین شیارزن با باوزی زنجیر دار : 9
  1ـ 6 ـ 2ـ ماشین هاواژ با دیسک برنده : 11
  1 ـ 6 ـ 3 : ماشین شیارزن با صفحه فرز : 11
  1 ـ 7 ـ روش استخراج هیدرومکانیکی : 12
  1 ـ 8 ـ روش استخراج به کمک حرارت : 13
  1 ـ 9 ـ روش استخراج با سیم برش فولادی : 13
  1ـ 10 ـ روش استخراج سنگ با سیم برش الماسه : 14
  فصل دوم : 16
  بررسی خواص فیزیکی ومکانیکی 16
  سنگ‌های ساختمانی ومقایسه آن با 16
  استاندارد ASTM 16
  2ـ 1 ـ مقدمه : 17
  2-2 خواص فیزیکی ومکانیکی سنگ های چینی ایران: 17
  2 ـ 3 مقایسه خواص فیزیکی ومکانیکی سنگ های چینی ایران با استاندارد ASTM : 27
  2 ـ 3 مقایسه خواص فیزیکی ومکانیکی سنگ های چینی ایران با استاندارد ASTM : 28
  فصل سوم : 32
  سیم برش الماسی و تعیین قطربیرونی 32
  سیم برش مطابق با استاندارد ASTM 32
  3ـ1 ـ مقدمه : 33
  3ـ2ـ1ـ دستگاه تأمین کننده حرکت سیم: 33
  3ـ2ـ2 ـ سیم برش الماسه : سیم برش الماسه به طور کلی شامل این قسمتهاست : 34
  3 ـ3 ـ مهره های الماسه دار ( سیگمنت ها ) : 34
  3 ـ4 ـ مشکلات ومعایب سیگمنت های آبکاری شده برقی : 34
  3ـ 5 ـ مزایای تولید سیم الماسه به صورت اشباع شده : 35
  اندازه گیری قطر بهینه سیم برش : 36
  3ـ 7 ـ آزمایشات مربوط به قطر بهینه سیم برش : 37
  3ـ 8 ـ مزایای استفاده از سیم برش الماسی 40
  فصل چهارم : 43
  نتیجه گیری و پیشنهادات 43

سیم برش الماسه و تعیین قطر بیرونی سیم برش و بیان استاندارد ASTM

اختصاصی از کوشا فایل سیم برش الماسه و تعیین قطر بیرونی سیم برش و بیان استاندارد ASTM دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

چکیده :

یکی ازپارامتر های مهم در انتخاب ابزار مناسب برش تخته سنگ ، شناخت نوع سنگ قابل برش و خواص فیزیکی و مکانیکی آن می باشد. در این راستا خواص مذکور بایستی با معیار های استاندارد ASTM مطابقت داشته تا پس از برش ، ارزش اقتصادی داشته و متناسب با آن خصوصیات ، بتوان ابزار مناسب برش را انتخاب نمود. یکی از ابزار های مهم مورد استفاده در برش تخته سنگ ، سیم برش الماسه می باشد.استفاده از این تکنولوژی در اکثر معادن جهان توسعه پیدا کرده و امتیازات ویژه ای نسبت به دیگر تکنیک های برش تخته سنگ دارد. این تکنولوژی شامل وارد کردن متالوژی ساییدن و چکش خواری همراه با چرخش می باشد . در این مطالعه سعی شده است که علاوه بر آشنایی با روش های مختلف برش تخته سنگ ، ترکیب سیم های مرکب الماسه دار و کابل های با مقاومت بالای ترکیب یافته از مس و نبوبیم و اندازه قطر بهینه سیم برش ، مورد بحث قرار گیرد.

فهرست مطالب :

چکیده

مقدمه　　

فصل اول　

آشنایی با روشهای مختلف استخراج سنگ　

1-1ـ مقدمه　

1ـ2ـ روش استخراج با چال های موازی　

1-3- استخراج بلوک به کمک پارس و گوه　　

1ـ4 ـ استخراج بلوک به شیوه مکانیکی　　

1 ـ 5 ـ استخراج به کمک مواد ناریه سبک　

1 ـ 6 ـ استخراج با ماشین های شیارزن ( هاواژ )　

1 ـ 6 ـ 1 ـ ماشین شیارزن با باوزی زنجیر دار　　

1ـ 6 ـ 2ـ ماشین هاواژ با دیسک برنده　　

1 ـ 6 ـ 3 : ماشین شیارزن با صفحه فرز　　

1 ـ 7 ـ روش استخراج هیدرومکانیکی　

1 ـ 8 ـ روش استخراج به کمک حرارت　　

1 ـ 9 ـ روش استخراج با سیم برش فولادی　

1ـ 10 ـ روش استخراج سنگ با سیم برش الماسه　　

فصل دوم　

بررسی خواص فیزیکی ومکانیکی　

سنگ‌های ساختمانی ومقایسه آن با　

استاندارد ASTM　

2ـ 1 ـ مقدمه　　

2-2 خواص فیزیکی ومکانیکی سنگ های چینی ایران　

2 ـ 3 مقایسه خواص فیزیکی ومکانیکی سنگ های چینی ایران با استاندارد ASTM　

2 ـ 3 مقایسه خواص فیزیکی ومکانیکی سنگ های چینی ایران با استاندارد ASTM　

فصل سوم　　

سیم برش الماسی و تعیین قطربیرونی

سیم برش مطابق با استاندارد ASTM

3ـ1 ـ مقدمه　

3ـ2ـ1ـ دستگاه تأمین کننده حرکت سیم

3ـ2ـ2 ـ سیم برش الماسه : سیم برش الماسه به طور کلی شامل این قسمتهاست　

3 ـ3 ـ مهره های الماسه دار ( سیگمنت ها )　

3 ـ4 ـ مشکلات ومعایب سیگمنت های آبکاری شده برقی　　

3ـ 5 ـ مزایای تولید سیم الماسه به صورت اشباع شده　　

اندازه گیری قطر بهینه سیم برش　　

3ـ 7 ـ آزمایشات مربوط به قطر بهینه سیم برش　

3ـ 8 ـ مزایای استفاده از سیم برش الماسی

فصل چهارم　　

نتیجه گیری و پیشنهادات

منابع　

پایان نامه تاثیر عصاره برگ گیاه جغجغه( prosopis farcta)بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز-1در موش های صحرایی دیابتی (نوع1)

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه تاثیر عصاره برگ گیاه جغجغه( prosopis farcta)بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز-1در موش های صحرایی دیابتی (نوع1) دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:92

پایان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی- ژنتیک

فهرست مطالب:

فصل اول: مقدمه وکلیات
1-1- مقدمه    2
2-1-کلیات تحقیق    3
1-2-1-دیابت    3
2-2-1- انواع دیابت    3
3-2-1- علائم بروز دیابت    4
4-2-1- درمان دیابت :    5
3-1- گیاه جغجغه ((Prosopis farcta    8
1-3-1- خواص دارویی جغجغه    8
4-1- فسفوفروکتوکیناز 1(PFK-1):    9
5-1- ضرورت و اهداف تحقیق :    13
فصل دوم: مروری بر منابع
1-2- اثرات ضد دیابتی گیاهان    16
1-1-2- انار    17
2-1-2-مکانیسم اثر انار در دیابت:    17
2-1-2- سیر    19
2-2- اثر گیاه برفعالیت وبیان ژن    21
فصل سوم: مواد و روشها
1-3- موادو روشها    25
2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه    27
3-3- حیوانات آزمایشگاهی    28
1-3-3- نحوه گروهبندی:    28
2-3-3- روش القای دیابت تجربی:    29
3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:    29
4-3-3- مراحل انجام تشریح:    29
4-3- بررسی بیان ژن    31
1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1    31
2-4-3- طراحی پرایمرها    35
3-4-3- آماده سازی پرایمر    35
5-3- استخراج RNA:    36
1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm    36
1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شده    38
6-3- سنتز cDNA    39
1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFIC    39
7-3- واکنش های PCR    41
1-7-3 - PCR شیب دمایی    41
2-7-3- PCR معمولی    43
8-3- الکترفورز    45
1-8-3 - مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز    45
1-1-8-3- آگارز    45
2-1-8-3- اتیدیوم بروماید    46
3-1-8-3- لودینگ بافر    46
4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl    46
4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA    47
9-3- روش کار با ژل الکترفورز    47
10-3- رسم منحنی استاندارد:    48
10-3- واکنش Real-Time PCR    48
11-3- Threshold و مقدار CT:    50
12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCR    51
10-2-3- آنالیز بیان ژن    52
13-3- تجزیه وتحلیل داده ها    52
فصل چهارم: نتایج و بحث
1-4- جمع آوری نمونه :    54
2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه    54
3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعه    56
5-4- نتایج استخراج RNA:    57
6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروز    59
7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتری    61
1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی    61
8-4- نتایج منحنی استاندارد    62
1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP    63
2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1    63
9-4- نتایج واکنش  Real Time PCR    64
1-9-4- تکثیر ژنPFK    65
2-9-4-تکثیر ژن TBP    66
10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:    66
1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFK    67
2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBP    67
11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK    68
12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP    68
13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارز    70
14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK    70
15-4- بحث:    71
16-4- پیشنهادات    73
منابع:    75

 فهرست جداول

جدول1-3- تجهیزات و دستگاهها    26
جدول 2-3 پرایمرهای طراحی شده    35
جدول3-3- لیست اجزای کیت استخراج RNA    36
جدول 4-3 موادلازم برای PCR    42
جدول 5-3 برنامه PCR شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل از TBP    42
جدول 6-3 برنامه PCR  شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل از PFK-1    43
جدول7-3 مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Tris-Hcl    47
جدول8-3 مواد و میزان مورد نیاز برای یک واکنش در Real-Time PCR    49
جدول9-3 مراحل، دما و زمان مربوطه در یک واکنش Real- time PCR  برای ژن TBP    50
جدول10-3- شرایط دمایی و زمانی واکنش Real time PCR برای ژن PFK-1    50
 

فهرست اشکال

شکل 1-1- محل قرارگرفتن فسفوفروکتوکیناز 1 در کروموزوم شماره 21 انسان    10
شکل2-1- فروکتوز 2-6 بی فسفات مهمترین فعال کننده آنزیم فسفوفروکتوکیناز 1    11
شکل3-1- مراحل گلیکولیز    12
شکل 1-3- نحوه گاواژ دادن عصاره    28
شکل 2-3-  تشریح موشها    30
شکل 3-3- توالی ژن pfk-1    34
شکل 4-3- دستگاه اسپکتوفتومتری    39
شکل 5-3 دستگاه PCR  (Eppendorf –mastercyc gradient)    44
شکل 6-3 دستگاه الکتروفورز وعکس ژل    48
شکل 7-3 دستگاه Real-Time PCR    49
شکل 1-4- فراوانی موشهای مورد مطالعه    54
شکل 2-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر وزن موشهای صحرایی    55
شکل 3-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر گلوکز ناشتای موشهای صحرایی    57
شکل 5-4- نتایج استخراج Total RNA    59
شکل 6-4- تکثیر قطعه (bp190)مربوط به ژن PFK .    60
شکل7-4- تکثیر قطعه (bp126) مربوط به ژن TBP.    60
شکل 8-4- نتایج شیب دمایی PCR  برای ژن  PFK     61
شکل 9-4- نتایج شیب دمایی  PCR برای ژن TBP    62
شکل 10-4- منحنی استاندارد ژن  TBP    63
شکل11-4- منحنی استاندارد ژنPFK    64
شکل 12-4- منحنی تکثیرژن PFK.    65
شکل 13-4- منحنی تکثیرژن TBP    66
شکل 14-4 تغییرات فلورسانت بر حسب دما برای ژن TBP و PFK    68
شکل 15-4- منحنی ذوب ژن PFK  و TBP    69
شکل 16-4- عکس ژل  برای ژن PFK1 نتایج حاصل از real- tim PVR    70
شکل 16-4- تغییرات بیان ژن TBP    70

چکیده:
دیابت قندی یکی از مشکلات مهم پزشکی در همه کشورها می‌باشد. امروزه، درد و رنج انسان نه تنها در مورد این بیماری به خودی خود، بلکه شامل عوارض مرتبط با دیابت است.  گیاهان نشان دهنده منبع عظیمی از مکمل¬های غذایی بالقوه مفید برای بهبود کنترل قند خون و جلوگیری از عوارض دراز مدت دیابت هستند. با توجه به تنوع گیاهان داروئی در ایران و با توجه به پتانسیل درمانی گیاهان داروئی و همچنین خطراتی که داروهای شیمیایی ممکن است در حال حاضر یا آینده برای بیماران ایجاد کنند، با بررسی تاثیر گیاهان دارویی در بیماری دیابت می¬توان راه¬های درمان مناسبی در پیش رو قرار داد.آنزیم  فسفو فروکتوکیناز -1 از آنزیمهای سیتوزولی در مسیر گلیکولیز می باشد که نقش کلیدی در روند تنظیم گلیکولیز دارد.عوارض ناشی از نقص موروثی آنزیم pfk-1 در عضلات اسکلتی بصورت خستگی و کاهش توان حرکات عضلانی می باشد. در مواردی هم نقص آن باعث رشدسریع سلولهای سرطانی می شود. درتحقیق حاضر به  تاثیر عصاره هیدر الکلی برگ گیاه جغجغه (با توجه به دارا بودن اثرات ضدالتهابی، ضد میکروبی و ضد دیابتی ) بر بیان ژن pfk-1در موشهای دیابتی نوع 1می پردازیم.
در این مطالعه 45 سر موش صحرایی نر به طور تصادفی در سه گروه شاهد سالم، شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تجویز عصاره جغجغه تقسیم شدند. با تزریق استرپتوزوتوسین (mg/kg 60) در موش¬های صحرایی نر (300-150 گرم) دیابت نوع 1 ایجاد شد.گروه دیابتی تحت تیمار به صورت روزانه (mg/kg 300) عصاره برگ گیاه جغجغه را به صورت گاواژ به مدت 30 روز دریافت نمودند. گروه شاهد سالم و شاهد دیابتی آب مقطر دریافت کردند. سپس در روز قبل از تجویز عصاره و روزهای 15 و 30 بعد از تجویز عصاره میزان گلوکز خون اندازه¬گیری شد و بیان ژن PFK-1 بافت کبدی توسط روش Real-Time PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد گلوکز خون در روز 15کاهش می یابد اما بین گروه شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تفاوت معنی داری مشاهده نشد میزان بیان ژن PFK در گروه دیابتی تحت تیمار در روز 15 تفاوت معنی داری نسبت به شاهد دیابتی ندارد در بین گروهها تفاوت معنی داری برای بیان ژنPFK  وجود ندارد. بنابراین تجویز عصاره هیدروالکی گیاه جغجغه بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز -1 در بیماران دیابتی نوع 1 بی تاثیر می باشد.

کلمات کلیدی: جغجغه، ژن فسفوفروکتو کیناز-1، دیابت نوع1

پایان نامه کلونینگ و بیان ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری E. coli جهش یافته و مقایسۀ خواص این آنزیم با نوع native آن

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه کلونینگ و بیان ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری E. coli جهش یافته و مقایسۀ خواص این آنزیم با نوع native آن دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:124

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد(M.Sc.)
گرایش میکروبیولوژی

فهرست مطالب:
چکیده ........................................................................................................................................................ 1
مقدمه ...........................................................................................................................................................3
فصل اول کلیات .................................................................................................................... 5
1-1-پیشینه تاریخی ................................................................................................................................... 6
1-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ........................................................................ 8
1-3-  آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ............................................................................................ 10
1-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو .................................................................................. 12
1-4-1  اثر ضد سرطانی .......................................................................................................................... 12
1-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان ..................................................................... 14
1-4-2-1 آنزیم طبیعی ............................................................................................................................ 14
1-4-2-2-آنزیم تغییریافته ...................................................................................................................... 16
1-5- فارماکوکنتیک ................................................................................................................................ 19
1-5-1- مقاومت دارویی ........................................................................................................................ 23
1-5-2-  تأثیر دارویی .......................................................................................................................... 25
1-6-سمیّت .......................................................................................................................................... 28
فصل دوم روش کار ......................................................................................................... 34
2-1- مواد و میکروارگانیسم ها .............................................................................................................35
2-2- کشت باکتری .............................................................................................................................. 35
2-3- اعمالUV  در زمان های مختلف ................................................................................................ 35
2-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ............................... 36
2-4-1- کشت کلنی ها ....................................................................................................................... 36
2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها ............... 37
2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها ......................... 38
2-5- استخراج  DNA......................................................................................................................... 40
2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج  DNA................................................................................ 40
2-5-2- استخراج DNA ژنومی .......................................................................................................... 41
2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)   ........................................................................................... 42
2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ................................................................................................. 43
2-8- خالص سازی محصول PCR .................................................................................................. 44
2-9- استخراج پلاسمید ................................................................................................................... 46
2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ............................................................... 47
2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll ....................................................................... 47
2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ........................................................................ 48
2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll  .................................. 48
2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید .............................................................. 49
2-12-انتخاب کلون های مثبت ....................................................................................................... 50
2-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی .............................................................. 51
2-13-1-PCR ................................................................................................................................ 51
2-13-2- هضم آنزیمی ................................................................................................................... 52
2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll ............................... 53
2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز  ll..................................................................... 53
2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll  و ال-آسپاراژیناز l .............................. 54
2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-
PAGE  ............................................................................................................................................. 55
 2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ............................... 58
2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ........................................................ 59
2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژیناز  .................................................. 62
2-19- کشت سلول انسانی  ............................................................................................................. 62
2-19-1- تهیه محیط کشت RPMI1640 ..................................................................................... 63
2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های
سرطانی انسانی  ............................................................................................................................... 63
2-20-1- MTT Assay ................................................................................................................ 63
2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ........................ 65
فصل سوم نتایج ........................................................................................................... 67
3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها ........................................................................................... 68
3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490 ............... 69
3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش
 یافته ................................................................................................................................................ 70
3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll  ...................................................................... 72
3-5- تعیین توالی قطعه ژنی l-aspsraginase ll  ....................................................................... 74
3-6- وارد کردن قطعه ژنی l-asparaginase ll  در وکتور pET23a و تأیید آن ...................... 76
3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد .............................. 79
3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU)  ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز
 استاندارد ......................................................................................................................................... 80
3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-
آسپاراژیناز استاندارد ........................................................................................................................ 82
3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و
 ال-آسپاراژیناز استاندارد ................................................................................................................. 84
3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول
 های سرطانی HeLa  ...................................................................................................................... 85
3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول
 های سرطانی LCL   ....................................................................................................................... 89
3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ..................... 97
فصل چهارم بحث و پیشنهادات .................................................................................. 98  
منابع ............................................................................................................................................... 108

 
 چکیده
ال- آسپاراژیناز آنزیمی است که موجب هیدرولیز آسپاراژین به اسید آسپاراتیک و آمونیاک می شود . نام دیگر آن ال-آسپار است . این آنزیم امروزه جهت درمان بیماری سرطان خون و برخی تومور ها استفاده می شود. بطور کلی سلولهای سرطانی قادر به سنتز اسید آمینه غیر ضروری آسپاراژین نیستند در حالی که سلولهای نرمال خودشان این اسید آمینه را می سازند لذا سلولهای سرطانی نیازمند به مقادیر بالا از آسپاراژین در حال گردش می باشند . ال- آسپاراژیناز با تجزیۀ ال-آسپاراژین مانع از دسترسی سلولهای سرطانی به منابع این اسیدآمینه می شود . مهمترین اثر جانبی این دارو حالت آلرژی یا واکنش افزایش حساسیت است . هدف ما از این تحقیق 1- تهیه پروتئین آنزیم ال-آسپاراژیناز از باکتری جهش یافته E. coli  . 2- تاثیر این پروتئین بر روی یک رده سلولی سرطانی به منظور ارزیابی فعالیت آن و 3- دستیابی به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر ، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر بوده است. لذا به منظور رسیدن به اهداف فوق مراحل آزمایشگاهی زیر انجام شد: 1- قرار دادن باکتری E. coli در معرض نور UV . 2- تخلیص  DNA و انجام PCR به منظور تکثیر ژن آنزیم. 3- قرار دادن سکانس در داخل پلاسمید  pET23a(+)  و انتقال به E. coli. 4- خالص سازی پروتئین و تعیین مقدار آن. 5-  تاثیر بر روی یک لاین سرطانی و تعیین مقدار تاثیر آن. به این ترتیب بعد از ایجاد جهش و سنجش میزان تولید و فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز در کلنی های جهش یافته و تخلیص و تکثیر ژن این آنزیم از باکتری هایی که ال-آسپار را بیش از حد معمول تولید می کردند، محصول PCR این ژن ها برای تعیین توالی ارسال گردید و پس از تعیین توالی و مطابقت با بانک ژن بین المللی ncbi ، سکانس قطعه ژنی ال-آسپاراژیناز II  از باکتری E. coli KIAU B1 به عنوان یک سکانس جدید در بانک ژن با کدGenBank: HQ116626.1  به ثبت رسید. ژن مذکور در وکتورpET23a(+)   کلون و سپس پلاسمید نوترکیب حاصل در سلول های E. coli BL21 ترانسفر شد. . از سلول های ترانسفر شده ،پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز استخراج شد و پس از سنجش این پروتئین آنزیمی با تست های نسلریزاسیون و برادفورد، میزان فعالیت آنزیمی(IU)  و پروتئین کلّی(mg) آن مشخص و با نمونۀ استاندارد مقایسه شد. همچنین از نظر تأثیر بر سلول های سرطانی HeLa و LCL  ، با نوع استاندارد قیاس شد. نتایج نشان داد که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز نوترکیب برابر باIU/mg  178 می باشد، در حالی که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز استانداردIU/mgr  77 به دست آمد. همچنین، آنزیم نوترکیب علاوه بر آن که از نظر سکانس و قدرت آنزیمی با نوع استاندارد تفاوت  نشان می دهد ، نسبت به آن به نحو موثرتری بر رده های سلولی سرطانی  HeLa و LCL  تاثیر می گذارد.
 

مقدمه
با توجه به شیوع روز افزون انواع سرطان به عنوان یکی از مهمترین بیماری های تهدید کنندۀ سلامت انسان، دستیابی به روش های موثرتر در درمان سرطان به ویژه انتخاب ترکیبات دارویی با عوارض جانبی کمتر بیش از گذشته مورد توجه محققین قرار گرفته است.
آنزیم ال-آسپاراژیناز به صورت اختصاصی اسیدآمینه ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیاک کاتالیز کرده و نقش مهمی را در متابولیسم همه ارگانیسم های زنده و نیز در داروشناسی بازی می کند(2). دو نوع ترکیب از ال-آسپاراژیناز وجود دارد : ال-آسپاراژیناز l، یک آنزیمconstitutive  داخلی، و ال-آسپاراژیناز ll، یک آنزیم خارجی می باشد. این دو آنزیم از لحاظ بیوشیمیایی و ساختار ژنتیکی متفاوتند. ال-آسپاراژیناز ll به صورت گسترده در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی وجود دارد و بیش از پنج دهه مورد مطالعه فراوان قرار گرفته است(66). این آنزیم از منابع گوناگون مانند سلول های گیاهی و حیوانی، قارچ ها، مخمرها و باکتری ها جدا شده است(61).
ال-آسپاراژینازll  یک عامل شیمی درمانی مهم می باشد که برای درمان نوعی از اختلالات لنفوپرولیفراتیو و لنفوما، به ویژه لوکمی لنفوبلاستیک حاد یا ALL  بکار برده می شود. این آنزیم بخش اصلی ترکیب پروتوکل های شیمی درمانی است که در درمان ALL  اطفال به مدت تقریباً 30  سال استفاده می شود (6،5،4،3،2،1). بر این اساس، همچنین این آنزیم در جدیدترین رژیم های درمانی چند عاملی برای ALL  بالغین قرار دارد (8،7). ال-آسپاراژیناز به عنوان یک دارو، اثربخشی خود را در درمان و مراحل بعدی استراتژی های مختلف شیمی درمانی اثبات کرده است. بزرگ ترین محدودیت استفاده از ال-آسپاراژیناز حساسیت شدید بالینی در دز اثر بخشی است، که در 78-3 درصد بیماران تحت درمان با فرم های اصلاح نشده آنزیم ظاهر می شود (11،10،9،3). با گذشت بیش از 10 سال به نظر می رسد پگ-ال-آسپاراژیناز به عنوان یک ترکیب جانشین برای ال-آسپاراژیناز ، مشکلات ناشی از انواع ترکیبات طبیعی را اصلاح کرده است (13،12). در این تحقیق سعی بر این شد تا با ایجاد جهش در باکتریKIAU  E. coli ، ارزیابی میزان تولید آنزیم ال-آسپاراژینازll  در سویه جهش یافته، و دستیابی به ترتیب توالی جدید در ژن این آنزیم و کلون کردن آن، بتوان ال-آسپاراژینازی استخراج کرد که از نظر فعالیت ویژه و اختصاصیت در سطح بالاتری نسبت به نوع استاندارد قرار داشته باشد. همچنین با تاثیر این پروتئین آنزیمی بر رده سلولی سرطانی و ارزیابی فعالیت و درصد کشندگی آن بر این سلول ها، بتوان به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر دست یافت.

فصل اول
کلیات

1-1-پیشینه تاریخی
نظریه اولیه که به منظور گسترش ال-آسپاراژیناز به عنوان یک عامل بالقوه آنتی نئوپلاستیک ثابت شد بسیار با اهمیت بوده و توسط Clementi  در سال 1922 طرح شد(20). وی آشکار ساخت که  فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز در سرم خوکچه هندی دیده می شود. فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز فقط در سرم خوکچه هندی مشاهده می شد، درحالیکه در سایر پستانداران این آنزیم یافت نمی شد. در سال 1953، Kidd عود لنفوماهای پیوندی در موش ها و رت ها را با خوکچه هندی مقایسه کرد و شرح داد(39). این فعالیت سایتوتوکسیک در سرم اسب یا خرگوش وجود نداشت. Neuman و McCoy  در سال 1956 این نظریه ها را گسترش دادند(45). آنها ثابت کردند که رشد لاین سلولی که از کارسینوسارکومای Walker مشتق شده مستلزم ال-آسپاراژین است. Haley در سال 1961 با استفاده از لاین سلولی مربوط به لوکمی موش نتایج مشابهی بدست آورد (29). و بالاخره Broome بود که در سال 1961 درحالیکه در آزمایشگاه Kidd کار می کرد ، یافته های Kidd مربوط به مهار رشد را با اولین نظریه که توسط Clementi ارائه شد مقایسه کرد و با موفقیت نتیجه گرفت که فعالیت آنتی لنفوما در سرم های خوکچه های هندی ناشی از ال-آسپاراژیناز موجود در سرم این حیوان می باشد (12).  تحقیقات بیشتر این شخص خصوصیت نهفته درمانی این آنزیم را تایید کرد (12،11). Yellin   وWriston   در سال 1966، موفق به خالص سازی جزئی دو ایزوفرم ال-آسپاراژیناز از سرم خوکچه هندی شدند (63). بطور قابل توجه ، فقط یک ایزوفرم در شرایط in vivo  فعالیت آنتی لنفوما را آشکار می ساخت (64،63) .
از آنجاییکه استخراج این آنزیم به مقادیر کافی از سرم خوکچه هندی مشکل بود ، سایر منابع نظیر میکروبها بررسی شدند. Mashburn و Wriston ، در سال 1964  و Campbell و Mashburn در سال 1969 از خالص سازی ال-آسپاراژیناز E. coli  خبر دادند، و ثابت کردند که فعالیت تومورکشی آن شبیه به نوع سرمی خوکچه هندی می باشد(64،15).  این یافته ها پایه عملی تولید آنزیم با مقادیر زیاد را برای تحقیقات بالینی و پیش بالینی فراهم کرد(17،16،15) . Oettgen در سال 1967 اولین کسی بود که تأثیر ال-آسپاراژیناز در انسان های مبتلا به لوکمی را نشان داد (46). بطور همزمان بررسی مهم دیگری توسط Old  انجام شد که فعالیت آنتی توموری این آنزیم را در شرایط in vivo در یک مدل سگی مبتلا به لنفوسارکوما  اثبات می کرد(47).
درمان  با استفاده از پروتئین ها در انسان ها محدودیت دارد زیرا منجر به ایمنی زایی دارو می شود که مشکلی اساسی می باشد. واکنش های حساسیت شدید نسبت به ال-آسپاراژیناز E. coli  بطور متوسط عمومیت دارد. یک بررسی هم زمان بر روی ال-آسپاراژیناز E. coli و Erwinia carotovora  فقدان واکنش تقاطعی را نشان می دهد (24). هرچند هردو آنزیم به میزان زیادی  سبب تحریک سیستم  ایمنی می گردند. تلاش ها در این زمینه موجب کاهش ایمنی زایی این دارو ها شده است و این در حالیست که فعالیت آنزیمی آن حفظ شده است. مشخص شده است اتصال این آنزیم به  پلی اتیلن گلایکل یا PEG  به عنوان یک پردازش، واکنش های ایمنی زایی این دارو را از بین می برد بدون آنکه در ویژگی آنتی نئوپلاستیک آن تغییر ایجاد کند(27). این ترکیب اصلاح شده دارو در مدل های حیوانی باعث کاهش تشکیل آنتی بادی در مقایسه با ترکیب بومی آن می شود، و بطور محسوس مدت اثرش را طولانی می کند(57،27). در سال های اخیر، استفاده از ال-آسپاراژیناز در درمان لوکمی و سایر اختلالات لنفوپرولیفراتیو بطور وسیع افزایش یافته است. در اوایل از آن تنها برای  بهبود  بیماران مبتلا به ALL استفاده می شد (36،35،34،33،32،31،30،2،1)؛ اما پس از  تحقیقات اخیر به منظور تقویت درمان بدخیمی های لنفوئید، عملکرد این آنزیم را به مدت 30-20 هفته تجویز می گردد(57) . به این دلایل است که ال-آسپاراژیناز به عنوان یک جزء ضروری در روش های نوین شیمی درمانی چند دارویی قرار گرفته است.