پایان نامه مقایسه بیان ژنهای TTK ،ARMC3 و TPTE در نمونه های بافت بیماران مبتلا به سرطان پستان با بافت نرمال

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه مقایسه بیان ژنهای TTK ،ARMC3 و TPTE در نمونه های بافت بیماران مبتلا به سرطان پستان با بافت نرمال دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:95

پایان نامه دوره کارشناسی ارشد در رشته بیوتکنولوژی پزشکی

فهرست مطالب:
فهرست مطالب    i
فهرست جداول    v
فهرست اشکال    vii
فصل اول: مقدمه و اهمیت  موضوع    1
1-1: مقدمه    2
1-2: اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق    3
1-3: اهداف طرح    4
1-3-1: هدف کلی    4
1-3-2: اهداف فرعی    4
1-3-3: اهداف کاربردی    5
1-4: فرضیات    5
فصل دوم: مروری بر مطالعات انجام شده    6
2-1: آناتومی و فیزیولوژی پستان    6
2-1-1: ساختار و عملکرد پستان    7
2-1-2: گردش خون پستان    8
2-1-3: تخلیه لنفاوی پستان    9
2-1-4: عصب رسانی پستان:    9
2-1-5: ناهنجاری‌های پستان    9
2-1-6: بیماری‌های خوش خیم پستان    9
2-2: سرطان پستان    10
2-2-1: شیوع سرطان پستان در جهان و ایران    10
2-2-2: کلیت سرطان پستان    11
2-2-3: سرطان درجا یا غیرتهاجمی    11
2-2-4: سرطان مهاجم پستان    12
2-2-5: علل ایجاد سرطان پستان    14
2-2-6: علائم سرطان پستان    16
2-2-7: تشخیص سرطان پستان    17
2-2-8: رده بندی سرطان پستان    19
2-2-9: درمان سرطان پستان    21
2-2-10: سرطان عود کننده پستان    24
2-2-11: سرطان پستان در مردان    24
2-3: ژنتیک سرطان    25
2-3-1:سرطان    25
2-3-2: انکوژن‌ها    26
2-3-3: ژنهای سرکوب کننده تومور    29
2-3-4: اختلالات تنظیم چرخهی سلولی در سرطان    29
2-3-5: P53 محافظ ژنوم    31
2-3-6: نقش BRCA1/2    31
2-3-7: نقص در ماشین ترمیم    32
2-3-8: توانایی تحریک رگزایی و متاستاز تومورهای بدخیم    32
2-3-9: بررسی مارکرها در خون افراد مبتلا به سرطان پستان    32
2-4: آنتی ژنهای سرطانی- بیضه ایی    33
2-4-1: کلاسه بندی ژنهای سرطانی-بیضه ای    34
2-4-2:تنظیم بیان آنتی ژنهای سرطانی – بیضه ایی    35
2-4-3: عملکرد ژنهای سرطانی-بیضه ای    35
2-4-4: ایمونوژنیسیته آنتی ژنهای سرطانی- بیضه ایی    35
2-4-5: ژنهای مورد بررسی: ARMC3, TPTE, TTK    36
2-5: مبانی تئوریک در  Real-Time PCR    38
2-5-1. کنترل داخلی :    39
فصل سوم: مواد و روش ها    41
3-1: نمونه گیری    42
3-1-1 .روش جمع آوری و تعداد نمونه ها    42
3-2.استخراج RNA از نمونه بافتهای جمع آوری شده    43
3-2-1 . محلول های مورد نیاز    43
3-2-2. روش استخراج RNA از بافت    43
3-2-3 .روش الکتروفورز کردن نمونه  RNAبر روی ژل آگارز 8/0 درصد    45
3-2-4. ظهور باندهای  RNAبر روی ژل    45
3-3. تیمار RNA  جهت حذف DNA ژنومی    45
3-4 .سنتز cDNA از RNA استخراج شده از بافت    46
3-5. طراحی پرایمر و پروب و بررسی کیفیت آنها :    46
3-5-1. غلظت بهینه پرایمر    47
3-5-2. آنالیز منحنی ذوب:    48
3-5-3. غلظت بهینه پروب:    48
3-5-4. تهیه سریال رقت به منظور بررسی کارائی پرایمرها :    48
3-6-. انجام تکنیک Real-Time PCR بر روی نمونه های مورد مطالعه :    48
3-6-1. تجزیه و تحلیل نتایج بدست آمده از  Real-Time PCR:    50
3-7. نحوه تجزیه و تحلیل داده ها:    51
فصل چهارم: نتایج و یافته ها    52
4-1. اطلاعات دموگرافیک جمعیت مورد مطالعه    53
4-2 :آنالیز RNA    54
4-2-1 :آنالیز کمی RNA    54
4-2-2 :آنالیز کیفی RNA    54
4-3. آنالیز کمی  RNA تیمار شده    55
4-4. بهینه سازی پرایمرها    56
4-4-1. آنالیز منحنی ذوب:    58
4-4-2.تعیین غلظت مناسب پروب:    59
4-5. نتایج Real-Time PCR    60
4-5-1. آمار توصیفی:    60
4-6. درصد بیان ژن ARMC3    63
4-7. درصد بیان ژن TPTE    65
4-8. درصد بیان ژن TTK    67
4-9. بررسی درصد بیان همزمان ژن‌های سرطانی- بیضه‌ایی    69
فصل پنجم:        بحث، نتیجه گیری    و پیشنهادها    70
پیشنهادات    74
Abstract:    76
References:    77

 
فهرست جداول

جدول3-2: دستورالعمل انجام واکنش بر اساس کیت سازنده    49
جدول3-3 :جدول برنامه زمانی Real-timePCR    49
جدول 4-1. خلاصه ای از اطلاعات دموگرافیک.    53
جدول 4-2 :نتایج اندازه گیری غلظت RNA در چند نمونه مجاور تومور و تومور    54
جدول 4-3 . نتایج غلظت  RNA تیمار شده در چند نمونه تومور و مجاور تومور    55
جدول4-4: توالی پرایمر و پروب استفاده شده در روش Real-Time PCR    56
جدول4-5 : چرخه های آستانه برای ژنها با غلظت های مختلف پرایمر    57
جدول 4-6: غلظت های بهینه پرایمر و پروب ها    58
جدول4-7: آمار توصیفی چرخه های آستانه.    60
جدول4-8: درصد بیان ARMC3 در نمونه های نرمال، تومور و مجاور تومور.    63
جدول4-9: درصد تغییرات بیان ARMC3 در نمونه تومور نسبت به مجاور    63
جدول4-10: میانگین ct در بیان ARMC3 در گروههای مختلف بیانی.    64
جدول4-11 :تفاوت  بیان ARMC3 در سه گروه افزایش، کاهش و عدم تغییر.    64
جدول4-12: درصد بیان TPTE در نمونه های نرمال، تومور و مجاور تومور.    65
جدول4-13: درصد تغییرات بیان TPTE در نمونه تومور نسبت به مجاور    65
جدول4-14: میانگین ct در بیان TPTE در گروههای مختلف بیانی.    66
جدول4-15: تفاوت  بیان TPTE در سه گروه افزایش، کاهش و عدم تغییر بیان.    66
جدول4-16: درصد بیان TTK در نمونه های نرمال، تومور و مجاور تومور.    67
جدول 4-17: درصد تغییرات بیان TTK در نمونه تومور نسبت به مجاور    67
جدول4-18. میانگین ct در بیان TTK در گروههای مختلف بیانی. T    68
جدول4-19: تفاوت  بیان TTK در سه گروه افزایش، کاهش و عدم تغییر بیان.    68
جدول4-20: بررسی درصد بیان همزمان ژن‌های سرطانی- بیضه‌ایی در نمونه‌های توموری    69

 

فهرست اشکال
شکل 1-1: شماتیکی از ساختار میکروسکوپی پستان    8
شکل1-2: ARMC3  دارای 19 اگزون می باشد    37
شکل 3-1. نمایی از برنامه دمایی دستگاه مورد استفاده    50
شکل 4-1. ظهور باندهای18S و 28SRNA ریبوزومی حاصل از الکتروفورز نمونه های RNA بر ژل اگارز 8/0%    55
شکل4-2. نتایج اولیه بهینه سازی پرایمرها.    57
شکل4-3: منحنی ذوب سمت راست ARMC3 وسط TPTE سمت چپ TTK    58
شکل 4-4. نتیجه انجام الکتروفورز بر روی محصولات PCR.    59
شکل 4-5. نمایی از Amplification Plot  ژنهای مورد بررسی.    62

چکیده :
مقدمه: سرطان پستان هنوز شایعترین سرطان در بین زنان می باشد. بیومارکرهایی که در بافت سرطانی بیان می شوند نقش مهمی درتشخیص، پیش آگهی و پاسخ به درمان دارند. ژن‌های سرطانی- بیضه‌ایی غالبا در بافت نرمال بیضه بیان می‌شوند ولی بیان برخی از آنها در انواعی از سرطان‌ها نیز گزارش شده است. چون بیضه یک مکان محافظت شونده از سیستم ایمنی می‌باشد، در صورت بیان این ژن‌ها در تومور می توان از آنها به عنوان اهداف‌ مناسبی برای ایمونوتراپی سرطان پستان استفاده کرد.
روش بررسی: پس از اخذ تعداد 95 نمونه شامل40 نمونه توموری، 40 نمونه مجاور تومور و 15 نمونه نرمال نمونه از بانک زیستی، استخراج RNA از آنها انجام گرفت. سپس RNA های استخراج شده  DNase Treatment  شده و از روی آنها cDNA  ساخته شد و با روش Real-Time PCR، بیان ژنهای ARMC3, TPTE,TTK   به همراه ACTB (کنترل داخلی) مورد بررسی قرار گرفت.
نتیجه: 43.6% از بافت توموری و 25.6%  بافت مجاور تومور رونوشت ARMC3 را بیان کردند.  ARMC3 در 41% از نمونه های تومور افزایش بیان و در 46.2%  کاهش بیان داشته است. همچنین بیان این ژن در  12.8% از نمونه های توموری بدون تغییر بود. این تغییرات از لحاظ آماری معنی دار بودند. 21.6% از بافت توموری و 8.1%  بافت مجاور تومور رونوشتTPTE را بیان کردند. TPTE در 34.1% از نمونه های تومور افزایش بیان و در 58.5% کاهش بیان داشته است. همچنین بیان این ژن در7.3%  از نمونه های توموری بدون تغییر بود. این تغییرات در هر سه گروه معنی دار بودند. 50% از بافت توموری و 20%  بافت مجاور تومور رونوشت TTK را بیان کردند. TTK  در 45%  نمونه های تومور افزایش بیان و در 50%  کاهش بیان داشته است. همچنین بیان این ژن در  5% از نمونه های توموری بدون تغییر بود که در گروههای افزایش و کاهش بیان معنی دار بودند.  لازم به ذکر است که هیچ نمونه نرمالی ژنهای مورد بررسی را بیان نکرد و نیز تمامی نمونه‌ها ژن ACTB را بیان کردند.
بحث: از انجایی که این ژنها دارای بیان بالاتری در نمونه توموری نسبت به مجاور تومور  بوده و نیز از انجا که در نمونه نرمال هیچ بیانی نداشتند حائز اهمیت می باشند. همچنین بیان برخی از این ژنها در بافت مجاور تومور ممکن است با مرحله سرطانی شدن مرتبط و شاید به این دلیل باشد که این بافتها تحت تاثیر تغییرات انکوژنیک و اپی ژنتیک سرطان پستان قرار می گیرند. با توجه به این نکات شاید بتوان از این ژنها به عنوان کاندیدی جهت مارکر‌های زیستی مناسب برای سرطان پستان در نظر گرفت.
کلمات کلیدی: سرطان پستان، ژن‌های سرطانی- بیضه ایی، مارکر زیستی، ایمونوتراپی

دانلود تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac

اختصاصی از کوشا فایل دانلود تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه 19S تلقیح می نمائیم. پس 48 تا 72 ساعت باکتریها رشد کرده و کدورت مناسبی را پیدا می کند. بقیه مراحل تخلیص کروموزوم بشرح زیر است:

1- 5/1 میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت 2 دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را دور می ریزیم.

2- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باکتری اضافه کرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یکساعت در دمای 0C37 نگهداری می نمائیم.

3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه کرده و بمدت 10 دققیق در  0C65 انکوبه می کنیم.

4- هم حجم مخلوط بالا از ترکیب کلروفرم – ایزوآمیل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می کنیم. محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.

5- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – کلروفرم – ایزوآمیل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.

هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.

1- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12

3- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector

4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39

5- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector

6- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین

7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

8- سنجشهای ایمونولوژیک

شامل 61 صفحه فایل word

بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac

اختصاصی از کوشا فایل بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

این فایل در قالب ورد و قابل ویرایش در 60 صفحه می باشد.

هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.

1- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12

3- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector

4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39

5- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector

6- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین

7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

8- سنجشهای ایمونولوژیک

باکتریها و پلاسمیدهایی که برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند:

باکتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالکی سویه

اشریشیالکی سویه BL21 – اشریشیاکی سویه BL21(DE3(Plyss

پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3

• جداسازی کروموزوم بروسلا آبورتوس 19S:

برای تکثیر ج داسازی ژنهای L7/L12 و P39 ابتدا کروموزوم باکتری جداسازی گردید.

مواد:

بافر TE:

Tris – Hel             10mm

EDTA                  1.0mm

‍PH بافر را پس از تهیه برروی 8 تنظیم می نمائیم.

پروتئیناز K:

CTAB/NaCl:

Nacl                      4.1gr

CTAB                  10gr

DDW                    100ml (Final Volume)

روش:

ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه 19S تلقیح می نمائیم. پس 48 تا 72 ساعت باکتریها رشد کرده و کدورت مناسبی را پیدا می کند. بقیه مراحل تخلیص کروموزوم بشرح زیر است:

1- 5/1 میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت 2 دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را دور می ریزیم.

2- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باکتری اضافه کرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یکساعت در دمای 0C37 نگهداری می نمائیم.

3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه کرده و بمدت 10 دققیق در  0C65 انکوبه می کنیم.

4- هم حجم مخلوط بالا از ترکیب کلروفرم – ایزوآمیل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می کنیم. محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.

5- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – کلروفرم – ایزوآمیل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.

6- هم حجم محلول روئی ایزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط می کنیم. پس از چند دقیقه DNA کروموزومی ته نشین شده که می توان بات یک پیپت پاستور آنرا جمع آوری نمائیم.

7- رسوب DNA کروموزومی را با الکل 70% شستشو داده و پس از خشک شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل می نمائیم.

بررسی کمی و کیفی DNA کروموزومی:

برای تعیین خلوط کروموزوم باکتری از مواد و وسایل زیر استفاده میشود.

1- بافر PBE   pH=8(10X)

Tris – base                               890mM

Boric Acid                               890mM

EDTA                                      25mM

2- آگارز MP

3- تانک الکتروفورز افقی

روش:

ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بکمک حرارت حل کرده و ژل آگارز افقی را سینی مخصوص تانک الکتروفورز افقی تهیه می نمائیم. سپس به مقدار Ml5 از DNA کروموزومی را در چلهک ژل ساخته شده ریخته و در تانک الکتروفورز حاوی بافر TBE(0.5x) پس از برقراری جریان الکتریکی مستقیم الکتروفورز می کنیم.

بریا تعیین مقدار DNA نیز پس از تهیه رقت  تز کروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج 260 نانومتر اندازه گیری می نمائیم. مقدار DNA بر اساس فرمول:عکس رقت  50  DD قرائت شده = مقدار DNA تعیین می گردد.

- مرحله پس از جداسازی کروموزوم تکثیر و جداسازی ژنهای مورد نظر است. این فرآیند با استفاده از دستگاه PCR انجام می گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پایه ای، ژن مورد نظر را می توان با استفاده از آنزیم تک پلی مرآز Tag Polymerase تکثیر نمود. عوامل پایه ای ذکر شده شامل موارد ذیل است.

1- قالب

2- پرایمر جلو Forward

3- پرایمر عقب Revers

4- دروکسی نوکلئوتیدها LNTP

5- منیزیوم

6- بافر

7- آنزیم پلی مرآز

8- آب مقطر استریل

برای تهیه پرایمرها ابتدا باید آنها را طراحی کرد. برای طراحی پرایمرهای ژن L7/L12 و P39 ابتدا مترادف نوکلئوتیدی ژنهای فوق را از مرکز اطلاعاتی NCBI بدست می آوریم.

accession No(L7/L12). L27819

accession No(P39). L35038

سپس بر این اساس و درنظر گرفتن نکات استاندارد طراحی پرایمر از جمله طول پرایمر، دمای اتصال G+C%، تولید پرایمر، تولید لوپ یا حلقه و ... ترادف پرایمرهای تعیین میگردد. در این مرحله از آنالیزهای کامپیوتری توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده میگردد.

ترادف ژن مورد نظر و پرایمرهای Forward و Reverse برای جداسازی ژنهای فوق از باکتری بروسلا به شرح زیر است:

• پرایمرهای L7/L12

Forward:

5’ GGA AAT   GCT GAT CTC GCA AA3’

Revers:

5’ CCA    CTT  GAG  TTC AAC XTT   GGC  CA3’

2- پرایمرهای P39

Forward:

5’ GCC     GGC   GCC   TGT   TGC   CAA 3’

Reverse:

5’ C CGC    TTT  TGC   GGC   TTC   AA  3’

جهت سهولت مراحل کلونینگ و با توجه به محلهای ممکن برای کلون سازی در پلاسمیدهای حد واسط و پلاسمیدهای بیانی دو جایگاه آنزیمی BamHI و XhoI درابتدا و انتهای پرایمر طراحی شده است. پرایمرهای طراحی شده توسط شرکت MWG آلمان ساخته شد.

برای انجام PCR از دستگاه TECHNE(Cambridge) مدل BENIUS استفاده شده است. برای بهینه سازی تکثیر ژنهای ذکر شده غلظتهای مختلف یون منیزیم (از 5/1 تا 5/3 میلی مولار) و دماهای مختلف مناسب برای اتصال پرایمرها با DNA کروموزومی (66-63 درجه سانتیگراد) بکار رفته است.

- تائید ژنوم سنتز شده توسط PCR:

برای تایید صحت قطعه ژنوم بدست آمده از PCR از هضم آنزیمی ژنهای فوق استفاده می گردد. چنانچه از هضم آنزیمی ژن L7/L12 با آنزیمهای EC0RI و Hind III بترتیب قطعات (168+206) و (305+69) باید دیده شود و از هضم آنزیمی ژن P39 با آنزیمهای NEOL و Hind III بترتیب قطعات (136+560+709) و (553+652) باید دیده شود.

برای تایید نهایی صحت ژنهای تکثیر شده از نظر ماهیت و ترادف نوکلئوتیدی آنها، این ژنها ابتدا در ناقل pSK+ کلون گردید و سپس برای تعیین سکانس به شرکت مربوط ارسال گردید.

- کلونینگ ژنهای L7/L12 و P39 در کلونینگ pSK+:

برای کلونینگ ژنهای فوق ابتدا باید ژنها تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسمیدی pSK نیز با آنزیمهای اخیر برش داده شود.

1- برش آنزیمی ژنهای L7/L12 و P39 با آنزیمهای BamHI و xhoI.

• برش آنزیمی پلاسمید pSK با آنزیمهای BamHI و xhoI پلاسمید pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. این پلاسمید دارای یک ناحیه تکثیری ColE1، یک ناحیه مقاومت به آمپی سیلین تحریک ناحیه f1 origin و یک ناحیه بنام multiple cloning site=MCS که جایگاه تعدادی از آنزیمهای تحدیدی را در خود دارد. برای تکثیز پلاسمید فوق از باکتری اشدیشیاکلی استفاده می گردد.
• برای برش آنزیمی این پلاسمید ابتدا باکتری حاوی این پلاسمید را تکثیر میدهد. در ضمن تکثیر باکتری پلاسمید مورد نظر در باکتری همانندسازی کرده و تعداد آن افزایش می یابد. برای تکثیر باکتری از کشت آن در ml2 محیط LB حاوی ng/ml50 آنتی بیوتیک آمپی سیلین استفاده می شود. پس از 18 ساعت کشت مورد نظر کدورت مناسب را پیدا میکند. پس از آن پلاسمید از باکتری تخلیص میگردد.

مواد:

1- SET buffer:

Sucrose                               50mM

EDTA                                 10mM

Tris-Hcl  pH 8                    15mM

2- بافر لیزکننده:

Lysis Buffer (1ml)

Na OH (2N)                        100ml

SDS (10%)                         100ml

DDW                                  800ml

3- استات پتاسیم 5 مولار با pH 4.2

Potassiun Acetate 5M         for 100ml

KAC (4M)                          60ml

Acetic Acid                         11.5ml

DDW                                  28.5ml