پایان نامه ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیک

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیک دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت:word(قابل ویرایش)

تعداد صفحات:175

چکیده:

دسفری اکسامینB،‌ تنها سیدروفوری است که فرم مزتیله آن (نمک متان سولفونات دسفری اکسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی، به منظور شلاته کردن بار اضافی آهن، استفاده می گردد.

به همین منظور جهت تولید دسفری اکسامین B، از سویه استرپتومایسس پیلوسوس استفاده گردید و سویه مربوطه در محیط کشت Soy bean کشت داده شد و دسفری اکسامین آن بوسیله استفاده از محلول فنل- کلروفرم و اتر استخراج گردید. به منظور طراحی این سیستم بیولوژیکی و افزایش بهره برداری از محصول مذکور از منابع کربن و نیتروژن مختلف استفاده گردید و تاثیر هر یک بر میزان دسفری اکسامین تولیدی بررسی شد. چنانچه مشاهده گردید که اسید آمینه ترئونین، افزایش قابل ملاحظه ای بر دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار %۱۲۵/۰ ترئونین، در محیط کشت Soy bean، بسیار مطلوب می باشد. از طرفی اثر ویتامین تیامین (B₁)بررسی گردید و مشاهده شد که تاثیر مثبت بر دسفر اکسامین تولیدی دارد و در رده بعد از اسید آمینه ترئونین قرار می گیرد. همچنین اثر اسید آمینه لوسین نیز بر تولید دسفری اکسامین مثبت بوده و در رده بعد از ویتامین تیامین (B₁) قرار می گیرد.

در ایـن تحقـیق از شلاته کننـده های کاتیونی EDTA، ۸-hydroxyquinoline  در محـیط کشت Soy bean استفاده شد و مشاهده گردید که شلاته کننده های مذکور اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین  دارند در نتیجه، کاتیونها، اثر مثبت بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی خواهند داشت به همین منظور مواد معدنی مختلف از جمله اثر

CaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O,ZnSO₄.7H₂O, MnCl₂, FeSO₄.7H₂O

و همچنین  اثرCaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O به طور همزمان در محیط کشت Soy bean بررسی گردید.

در این تحقیق نتایج مطلوبی بدست آمد، بطوری که کلسیم (بصورت CaCl₂.2H₂O) اثر قابل ملاحظه‌ای بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار ۸/۲، و ۲، CaCl₂.2H₂O سبب افزایش قابل توجهی بر میزان محصول مذکور می گردد. و بدین ترتیب تاثیر مثبت کلسیم، بر تولید دسفری اکسامین مشخص گردید.

در این آزمایشات تاثیر مثبت روی، منیزیم و منگنز بر دسفری اکسامین تولیدی آشکار گردید بطوری که غلظت  ^۲-۱۰ × ۴/۰، ZnSO₄.7H₂O و  ۶/۰، MgSO₄.7H₂O و  ۲، MnCl₂ سبب افزایش تولید دسفری اکسامین شد.

مقدمه:

چه قدر زیبا و شاعرانه است که انسان به نوای دلنواز عاشقانه‌ای که در دل موجودات زنده نواخته می شود گوش دهد. تمام پدیده های هستی که زائیده اراده و مشیت الهی هستند منظر شناخت خداوند قادرند و چه با شکوه است علمی که انسان طالب معرفت را به سرچشمه شناخت این پدیده ها راهنمایی کند.

چشم دل بازکن که جان بینی                                  آنچه نادیدنی است آن بینی

امروزه عرصه ای از حیات بشری را نمی توان یافت که تأثیر مثبت از بیوتکنولوژی نداشته باشد. کلمه بیوتکنولوژی که از دو بخش بیو (به معنی زندگی و موجودات زنده) و تکنولوژی (به معنای هنر بشر در استفاده از علم) تشکیل شده است بطور کلی بیوتکنولوژی به مفهوم استفاده از موجودات زنده، اندام ها و سلولهای آنها برای تولید یک فرآورده با خدمات با ارزش اقتصادی به منظور بهبودرفاه بشر می باشد. بعبارت دیگر بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با استفاده از موجودات و متابولیتهای آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی، غذایی، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحث می کند.

سرآغاز بیوتکنولوژی به ده هزار سال پیش برمی گردد.  روند تکاملی بیوتکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته است، ولی بیوتکنولوژی مدرن در اواسط دهه 70 متولد شد. از همان آغاز، بیوتکنولوژی در قالب مهندسی شیمی توسعه یافت، از این رو با توسعه ی فرآیندهای صنعتی، گستردگی بیشتری پیدا کرد. بیوتکنولوژی از تکنیکهای مختلف ژنتیک، میکروبیولوژی کاربردی، شیمی، بیو شیمی، بیو لوژی، مهندسی فرآیند و غیره تشکیل می‌شود.

ابزار توانمند بیوتکنولوژی در پزشکی، کشاورزی، حفاظت از محیط زیست انقلاب عظیمی را بوجود آورد و امیدی برای حل بسیاری از مشکلات حاد بشر در سده بیست و یکم است.

بیوتکنولوژی علمی است که بهترین راه برای یافتن علت بیماری ها و درمان آنها مورد استفاده قرار می‌گیرد بطوری که در زمینه بهداشت تحولی عظیم ایجاد کرده است.انتقال وبیان ژنهای موجودات زنده و نوترکیبی آنها در آزمایشگاه به تولید محصولاتی که در پیشگیری و تشخیص و درمان بیماری ها کاربرد دارند از مهمترین عرصه های بکارگیری این دانش در توسعه ارتقاء سلامت و بهداشت جامعه و کنترل بیماری های عفونی و غیر عفونی می باشد. تشخیص دقیق و سریعتر بیماریها از جمله ناهنجاریهای ژنتیک و غربالگری از آنها، تشخیص پیش از تولد،استفاده از سلولهای بنیادین و سلولهای پایه و جنینی در مطالعات پایه و کاربردی پزشکی، تولید داروهای نوترکیب، تشخیص هویت، xenotransplantation با استفاده از حیوانات برای تولید بافت و اندام های مورد نیاز انسان، ژن درمانی و درمان بسیاری از بیماریهای صعب العلاج و تولید پروبیوتیک ها، بهبود کیفیت مواد غذایی و از همه مهم تر درک فرآیندهای زیستی عوامل بیماری زا، مکانیزم عمل آنها و تدبیر راهبردهای جدید بهداشت و درمان، تنها تعدادی از کارهای بیوتکنولوژی در عرصه بهداشت و پزشکی است.

 

و چه زیبا خداوند متعال، این علم را در سوره علق به انسان آموخته است.

بسم الله الرَّحمنِ الرَّحیم

اِقْرَاْ بِاسْمِ رَبِّک الَّذی خَلَقْ [1] خَلَقَ اِلْأنْسانَ مِنْ عَلَقٍ [2] اِقْرَاْ و رَبُّکَ اَلْاَکْرَمُ [3]

اَلَّذی عَلَّمَ بِالْقَلَمِ [4] عَلَّمَ الْأنسانَ مالَمْ یَعْلَمْ [5]

ای رسول گرامی قرآن را به نام پروردگارت که خدای آفریننده عالم است بر خلق قرائت کن  آن خدائی که آدمی را از خون بسته بیافرید  بخوان قرآن را و پروردگارت کریمترین کریمان عالم است  آن خدایی که بشر را علم نوشتن بقلم آموخت  و به آدم آنچه را که نمی دانست به الهام خود تعلیم داد

این کلام الهی در کمال ایجاز و اختصار اشاره به تمامی علوم از جمله بیوتکنولوژی دارد، چنانچه در آیه دوم سوره علق، علق (خون بسته) بیانگر سلولهای بنیادی می باشد و خدا در آیه عَلَّمَ الْأِنسانَ مالَمْ یَعْلَمْ ( و به آدم آنچه را که نمی دانست به الهام خود تعلیم داد) بیان داشته است که در کلام قرآن علوم مختلف به انسان الهام و تعلیم داده شده است و همانطور که خداوند بارها تاکید بر تفکر و تعقل در قرآن فرموده است می توان با استعانت از آیات الهی بر بسیاری از علوم فائق آمد.

یقیناً افق روشنتر، در گرو استفاده از ارگانیسمهایی است که بطور ژنتیکی برای تولید فراورده های غیر میکروبی مانند انسولین، اینترفرون، هورمون رشد انسان، واکسنهای ویروسی مهندسی شده اند. چنانچه به تازگی داروی نوترکیب انسانی (Human recombinent) اینترفرون به دست توانای دانشمندان ایرانی ساخته شد و ایران سومین کشور بعد از آمریکا و آلمان در تولید این فرآورده بیوتکنولوژی می‌باشد.

پس از تولید انسولین انسانی برای درمان دیابت، بیوتکنولوژی همچنان به خلق داروهای جدید و واکسن ها ادامه داده است. این داروها به میلیونها انسانی که در سرتاسر جهان به بیماریهای قلبی، سرطان، دیابت، پارکینسون، آلزایمر، ایدزو…. مبتلا هستند، کمک کرده اند.

طی سالهای 1925 تا 1965 استفاده از میکروبها در صنایع دارویی بصورت یک تحول اساسی، زمینه را برای بکارگرفتن میکروارگانیسم ها در تولید آنتی‌بیوتیک ها، هورمونها، ویتامینها، داروها و غیره فراهم ساخت. همگام با توسعه آنتی بیوتیک های جدید، تولید اسیدهای آمینه و نوکلئوتیدها نیز با موفقیت به انجام رسید. از زمانی که کشف گردیده بعضی از واکنشهای شیمیایی مشکل در ساخت استروئیدها، می توانند توسط میکروارگانیسم ها با راندمان بالایی انجام شوند، تولید آسان هورمونهای استروئیدی مهم در پزشکی امکان پذیر شد. علاوه بر این تعداد زیادی از فرآیندهای تولید آنزیم برای مصارف صنعتی، تجزیه ای، پزشکی نیز توسعه یافتند. مرحله برجسته‌تر پیشرفت بیوتکنولوژی، زمانی روی داد که فرایندهای تخمیری مداوم تکمیل شدند. این فرایندها اولین بار به منظور تولید غذای انسان و خوراک دام از باکتریها و مخمرها (پروتئین تک یاخته) استفاده شدند.

شبیه سازی دام، تولید حیوانات ترا ریخته برای بهبود کیفیت و کمیت تولید، تولید آنزیمها، در عرصه محیط زیست، کاهش مصرف سموم شیمیایی، فروشویی معادن با استفاده از ریزساز واره ها، حتی احیای موجودات منقرض شده از جمله دستاوردهای غیر قابل انکار این فناوری هستند.  همچنین برای تولید سوختهای بیولوژی و پاکسازی آلودگی ها و پسماندها از آن استفاده می شود. امروزه به لحاظ خطر کمیاب شدن نفت، تولید اتانول سوختی به کمک مواد نشاسته ای شروع شده است، و فرآیندهای میکروبی قدیمی برای ساخت استون و بوتانول از نشاسته ( در دهه 1920 و 1930 توسعه یافته اند) رونق تازه یافته است. برای تولید میکروبی سوخت ها از مواد زائد سلولزی، پتانسیل زیادی وجود دارد اما تا به امروز، این قبیل فرآیندها، هنوز در مرحله آزمایشگاهی خود باقی مانده اند.

داروهایی که از طریق بیوتکنولوژی تهیه می شوند به مراتب کمتر از داروهایی که از طریق شیمیایی سنتز می‌شوند دارای اثرات زیانبار جانبی هستند همچنین بیوتکنولوژی قادر به ساخت داروهای پیچیده ای است که بطریق دیگر نمی‌توان آنها را تولید کرد. بیوتکنولوژی به ویژه با استفاده از روشهای DNA نوترکیب، نقش مهمی در تولید داروها و واکسن ها ایفا کرده است.

داروی دسفرال از جمله داروهایی است که از طریق بیوتکنولوژی تهیه می شود. هم اکنون تولید صنعتی دسفری اکسامین بوسیله تخمیر سویه ای جهش یافته از استرپتومایسس پیلوسوس توسط شرکت نواریتس انجام می شود. بطوری که نمک متان سولفونات دسفری اکسامینB (فرم مزتیله دسفری اکسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی استفاده می گردد.

ما امیدواریم به یاری خداوند متعال و استعانت از کتاب الهی ( قرآن کریم) و سعی و تلاش محققین کشورمان، به پیشرفت های گسترده تری در این زمینه دست یابیم و کشور عزیزمان در کلیه زمینه های علمی و فرهنگی به بالاترین پیشرفت‌ها نایل آید. و با تولید این دارو، بتوان خدمتی به بیماران تالاسمی کشورمان که از این بیماری رنج می برند، نمود.

فهرست مطالب:

عنوان                                                                                                               صفحه

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………. ۱

مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………….. ۳

فصل اول

۱-۱ – تالاسمی……………………………………………………………………………………………………………… ۸

۱-۲-اتیولوژی و سبب شناسی تالاسمی……………………………………………………………………………….. ۸

۱-۲-۱ – خون شناسی…………………………………………………………………………………………………….. ۹

۱-۲-۲- خون سازی و گلبولهای قرمز……………………………………………………………………………….. ۱۰

۱-۳- تالاسمی و انواع آن………………………………………………………………………………………………. ۱۰

۱-۳-۱ آلفا تالاسمی……………………………………………………………………………………………………… ۱۰

۱-۳-۲- بتا تالاسمی……………………………………………………………………………………………………… ۱۱

۱-۳-۲-۱ بتا تالاسمی مینور(سالم ناقل)……………………………………………………………………………… ۱۱

۱-۳-۲-۲ – بتا تالاسمی ماژور( بیماری تالاسمی)………………………………………………………………… ۱۲

۱-۳-۲-۳-بتا تالاسمی بینابینی…………………………………………………………………………………………. ۱۳

۱-۴- تشخیص تالاسمی………………………………………………………………………………………………… ۱۳

۱-۵- درمان تالاسمی…………………………………………………………………………………………………….. ۱۳

۱-۶- فیزیولوژی عنصر آهن و اهمیت آن در بدن انسان…………………………………………………………. ۱۴

۱-۶-۱- مسمومیت حاد آهنی………………………………………………………………………………………….. ۱۵

۱-۷- دسفرال……………………………………………………………………………………………………………… ۱۶

۱-۷-۱- نحوه استفاده از داروی دسفرال…………………………………………………………………………….. ۱۷

۱-۷-۲-کاربردهای داروی دسفرال در پزشکی…………………………………………………………………….. ۱۸

۱-۷-۳- عوارض ناشی از داروی دسفرال…………………………………………………………………………… ۱۹

۱-۷-۴- اقدامات احتیاطی در مورد داروی دسفرال……………………………………………………………….. ۱۹

۱-۷-۵- ملاک توقف درمان بوسیله دسفرال………………………………………………………………………… ۲۰

فصل دوم

۲-۱-  سیدرو فورها……………………………………………………………………………………………………… ۲۲

۲-۱-۱- هیدروکسامات ها……………………………………………………………………………………………… ۲۴

۲-۱-۲-فنولات ها یا کاتکولات ها……………………………………………………………………………………. ۲۵

۲-۲- دسفری اکسامین ها………………………………………………………………………………………………. ۲۶

۲- ۲-۱ – ساختمان دسفری اکسامین………………………………………………………………………………… ۲۸

۲-۲-۲- دسفراکسامین بصورت آنتی اکسیدان……………………………………………………………………… ۲۸

۲-۲-۳ – خصوصیات فیزیکو و شیمیایی دسفراکسامین…………………………………………………………. ۲۹

۲-۲-۴- مکانیسم دسفراکسامین در جلوگیری از بیماریهای با بار اضافی آهن………………………………. ۲۹

۲-۲-۵- تشکیل رادیکال  DFO nitroxide…………………………………………………………………….. 30

2-3-  دسفری اکسامین B……………………………………………………………………………………………… 31

2-3-1- بیوسنتر دسفری اکسامین B…………………………………………………………………………………. 33

2-3-2- ژنهای کد کننده دسفری اکسامین B………………………………………………………………………. 33

2-4- تولید کننده­های دسفری اکسامین………………………………………………………………………………. ۳۴

۲-۵- اهمیت آهن بر روی میکروارگانیسمها……………………………………………………………………….. ۳۵

۲-۶- مکانیسم عمل سیدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول میکروارگانیسمها………………. ۳۶

۲-۷- تولید، استخراج و تخلیص دسفری اکسامین B…………………………………………………………….. 37

فصل سوم

۳-۱- اکتینومیست ها…………………………………………………………………………………………………….. ۴۰

۳-۲- استرپتومایسس ها…………………………………………………………………………………………………. ۴۳

۳-۲-۱- پاتولوژی………………………………………………………………………………………………………… ۴۳

۳-۲-۲ – مرفولوژی و ساختمان………………………………………………………………………………………. ۴۳

۳-۲-۳- مشخصات کلنی……………………………………………………………………………………………… ۴۵۴

۳-۲-۴- اسپورزایی……………………………………………………………………………………………………….. ۴۷

۳-۲-۵- ترکیبات پوشش سلولی………………………………………………………………………………………. ۴۹

۳-۲-۶- تغذیه و فاکتورهای موثر بر رشد و خصوصیات فیزیکوشیمیایی…………………………………….. ۴۹

۳-۲-۶-۱- تغذیه…………………………………………………………………………………………………………. ۴۹

۳-۲-۶-۲- اکسیژن……………………………………………………………………………………………………….. ۵۰

3-2-6-3 – رطوبت……………………………………………………………………………………………………… ۵۰

۳-۲-۶-۴- دما…………………………………………………………………………………………………………….. ۵۱

۳-۲-۶-۵- pH…………………………………………………………………………………………………………… 51

3-2-6-6- اکولوژی……………………………………………………………………………………………………… ۵۲

۳-۲-۶-۷- بیولوژی توسعه یافته استرپتومایسس…………………………………………………………………… ۵۳

۳-۲-۷- انواع فرآورده های میکروبی………………………………………………………………………………… ۵۶

۳-۲-۷-۱- متابولیت های اولیه………………………………………………………………………………………… ۵۶

۳-۲-۷-۲- متابولیت های ثانویه……………………………………………………………………………………….. ۵۶

۳-۲-۷-۲-۱- آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………. ۵۸

۳-۲-۷-۲-۱-۱- فیزیولوژی و تنظیم تولید آنتی بیوتیک…………………………………………………………. ۵۸

۳-۲-۷-۳- آنزیمها……………………………………………………………………………………………………….. ۶۳

۳-۲-۷-۳-۱- پروتئازها…………………………………………………………………………………………………. ۶۳

۳-۲-۷-۳-۱-۱- پروتئازهای اسیدی…………………………………………………………………………………. ۶۷

۳-۲-۷-۳-۱-۱-۱- رنین……………………………………………………………………………………………….. ۶۷

۳-۲-۷-۳-۱-۲- پروتئازهای خنثی…………………………………………………………………………………… ۶۷

۳-۲-۷-۳-۱-۳- پروتئاز های قلیایی…………………………………………………………………………………. ۶۷

۳-۲-۷-۳-۱-۳-۱- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی…………………………………………………………….. ۶۸

۳-۲-۷-۳-۱-۳-۲- تعیین فعالیت پروتئاز قلیایی………………………………………………………………….. ۶۹

۳-۲-۷-۳-۱-۴- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها……………………………………….. ۶۹

۳-۲-۷-۳-۱-۵- تجزیه…………………………………………………………………………………………………. ۷۱

۳-۲-۷-۳-۱-۶- پروتئاز ها و استرپتومایسسها…………………………………………………………………….. ۷۱

۳-۲-۸- محیط کشت  تخمیر صنعتی………………………………………………………………………………… ۷۱

۳-۲-۸-۱- نیازهای غذایی میکروارگانیسم‌ها……………………………………………………………………….. ۷۱

۳-۲-۸-۱-۱- کربن………………………………………………………………………………………………………. ۷۴

۳-۲-۸-۱-۱-۱- منابع کربن و استرپتومایسس ها…………………………………………………………………. ۷۷

۳-۲-۸-۱-۲-نیتروژن……………………………………………………………………………………………………. ۷۸

۳-۲-۸-۱-۲-۱-  منابع نیتروژن و استرپتومایسس ها…………………………………………………………….. ۸۰

۳-۲-۸-۱-۳- هیدروژن و اکسیژن……………………………………………………………………………………. ۸۰

3-2-8-1-4- مواد معدنی………………………………………………………………………………………………. ۸۰

۳-۲-۸-۲-تنظیم کننده های متابولیکی………………………………………………………………………………… ۸۱

۳-۲-۸-۳- ضد کف ها…………………………………………………………………………………………………. ۸۲

۳-۲-۹- بیوسنتز  در استرپتومایسس ها………………………………………………………………………………. ۸۳

فصل چهارم

۴-۱- دستگاه های مورد استفاده……………………………………………………………………………………….. ۸۶

۴-۲- وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………………. ۸۶

۴-۳ – محیط های کشت مایع برای رشد باکتری………………………………………………………………….. ۸۸

۴-۴- محیط های کشت جامد برای رشد باکتری………………………………………………………………….. ۸۹

۴-۵- محیط های جامد برای تولید اسپور……………………………………………………………………………. ۸۹

۴-۶- مواد لازم جهت رنگ آمیزی گرم……………………………………………………………………………… ۹۰

۴-۷- مواد لازم جهت استفاده از میکروسکوپ نوری…………………………………………………………….. ۹۱

۴-۸- محیط مورد استفاده جهت شناسایی کیفی دسفری اکسامین: محیط Des₄……………………………. 91

4-9- محیط مورد استفاده جهت اندازه گیری تولید دسفری اکسامین محیط Soy bean ………………. 91

4-10- مواد لازم جهت نگهداری و ذخیره باکتری ها…………………………………………………………….. ۹۲

۴-۱۱- معرف های دسفری اکسامین…………………………………………………………………………………. ۹۲

۴-۱۲- مواد لازم جهت رسم منحنی استاندارد دسفری اکسامین B……………………………………………. 92

4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفری اکسامین………………………………………………………………… ۹۲

۴-۱۴- مواد لازم جهت تهیه محلول Lysing Buffer…………………………………………………………. 93

4-14-1 – مواد لازم جهت تهیه محلول Tris Hcl……………………………………………………………… 93

4-15- محلول کازئین %۵/۰ دربافر فسفات…………………………………………………………………………. ۹۳

۴-۱۵-۱- بافر فسفات (PBS)……………………………………………………………………………………….. 93

4-16- محلول لوری (Lowry)……………………………………………………………………………………… 93

فصل پنجم

۵ – ١- تهیه و آماده سازی سویه استرپتومایسس پیلوسوس…………………………………………………….. ۹۸

۵ ـ ٢ ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی سویه استرپتومایسس پیلوسوس……………………………………. ۹۸

۵-٢-١- خصوصیات ماکروسکوپی…………………………………………………………………………………… ۹۹

۵- ٢-١-١- کشت استرپتومایسس پیلوسوس بر روی محیط جامد……………………………………………. ۹۹

5-٢-١-٢- کشت استرپتومایسس پیلوسوس در محیط مایع…………………………………………………….. ۹۹

۵-٢-٢ خصوصیات میکروسکوپی…………………………………………………………………………………….. ۹۹

۵-٢-٢-١- تهیه لام از محیط کشت جامد…………………………………………………………………………… ۹۹

۵-٢-٢-٢- تهیه لام از محیط کشت مایع………………………………………………………………………….. ۱۰۰

۵ـ ٢ـ٢ـ ٣ـ رنگ آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………. ۱۰۰

۵ ـ ٣ـ تهیه مایع تلقیح…………………………………………………………………………………………………. ۱۰۰

۵ ـ ٣ـ ١ـ تهیه محیط ذخیره………………………………………………………………………………………….. ۱۰۱

۵ ـ ٣ـ ٢ـ تهیه سوسپانسیون اسپور………………………………………………………………………………….. ۱۰۱

۵ـ ۴ـ رسم منحنی رشد استرپتومایسس پیلوسوس……………………………………………………………….. ۱۰۱

۵ـ ۵ـ بررسی تغییرات  pH در محیط کشت Soybean…………………………………………………….. 102

5ـ ۶ـ تولید دسفری اکسامین توسط استرپتومایسس پیلوسوس……………………………………………….. ۱۰۲

۵ـ ۶ـ ١ـ تشخیص کیفی دسفری اکسامین………………………………………………………………………… ۱۰۲

۵ـ ۶ـ ٢ـ سنجش میزان تولید دسفری اکسامین در هر روز…………………………………………………….. ۱۰۳

۵-۶-۳- رسم منحنی استاندارد دسفرال…………………………………………………………………………….. ۱۰۳

۵-٧ـ استخراج دسفری اکسامین بوسیله فنل-کلروفرم………………………………………………………….. ۱۰۴

 ۵ ـ ٧ـ ١ـ مزتیله کردن دسفری اکسامین………………………………………………………………………….. ۱۰۵

۵-۸- تعیین وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده………………………………………………… ۱۰۵

۵ـ ٩ـ  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین………………………………………………………… ۱۰۷

۵ـ ٩ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین……………………………………………. ۱۰۷

۵ ـ ٩ـ ١ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت………… ۱۰۷

۵ـ ٩ـ ٢ـ بررسی اثر اسیدآمینه ترئونین و اسید آمینه لوسین و ویتامین تیامینB₁)  ( برتولید دسفری اکسامین ۱۰۸

۵ ـ ٩ـ ٣ـ بررسی گلوکز و ملاس و سوکروز بر تولید دسفری اکسامین……………………………………. ۱۰۸

۵ـ ٩ـ ۴ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر تولید دسفری اکسامین…………………………………….. ۱۰۸

۵ ـ ٩ـ ۵ـ  استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean……….. 109

5 ـ ٩ـ ۶ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………………. ۱۰۹

۵ ـ٩ـ۶ـ١ـ بررسی تاثیر مواد معدنی در غلظت های مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین………….. ۱۱۱

5 ـ ١٠ – بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته  کننده ها و مواد معدنی مختلف        ۱۱۲

۵ ـ ١٠ـ ١ـ کشت باکتری و سنجش پروتئاز……………………………………………………………………… ۱۱۲

۵ ـ ١٠ـ ۲ـ تخلیص کازئین…………………………………………………………………………………………… ۱۱۳

فصل ششم

۶ـ ١ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی ماکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس………………………….. ۱۱۵

۶ـ ١ـ ١­ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد بر روی محیط کشت جامد………………………….. ۱۱۵

۶ ـ ١ـ٢ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد در محیط کشت مایع…………………………………. ۱۱۵

۶ ـ ٢ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی میکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس………………………… ۱۱۶

۶ ـ٣ـ رسم منحنی رشد استرپتوماسیس پیلوسوس در محیط کشت MYB……………………………….. 116

6-4- رسم منحنی pH بر حسب زمان در محیط کشت Soybean حاوی سویه استرپتومایسس پیلوسس…. ۱۱۸

۶ ـ ۵ـ تشخیص کیفی و کمی دسفری اکسامین تولیدی………………………………………………………… ۱۲۰

۶-۵-۱- تشخیص کیفی و تولید و یا عدم تولید دسفری اکسامین……………………………………………. ۱۲۰

۶ـ۵ـ۲ـ رسم نمودار استاندارد دسفرال……………………………………………………………………………… ۱۲۰

۶ـ۵ـ۳ـ میزان دسفری اکسامین تولیدی در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محیط Soy bean……………………………………………………………………………………………………………………………… 121

6-6- نتایج مربوط به استخراج دسفری اکسامین تولید شده توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس…… ۱۲۲

۶-۶-۱- نتایج مربوط به تأیید وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده………………………….. ۱۲۲

۶-۷-  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین………………………………………………………… ۱۲۴

۶-۷-۱  بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین……………………………………………… ۱۲۴

۶-۷-۱-۱- بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت…………… ۱۲۴

۶ـ۷ـ ٢ـ بررسی اثر اسید آمینه های ترئونین و لوسین و ویتامین تیامین (B₁ )…………………………….. 126

6 ـ ۷ـ٣ـ بررسی گلوکز ، ملاس، سوکروز بر تولید دسفری اکسامین………………………………………… ۱۲۶

۶ـ ۷ـ ۴ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………….. ۱۲۷

۶ـ ۷ـ ۵ـ استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean………….. 128

6 ـ ۷ـ ۶ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………………. ۱۲۸

۶ – ۷ – ۶ – ۱ – بررسی اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر میزان تولید دسفری اکسامین ……….. ۱۳۰

6ـ۸ـ بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته‌کننده و مواد معدنی مختلف ۱۳۹

فصل هفتم

– بحث و نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………….. ۱۴۳

– پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………