لینک پرداخت و دانلود در "پایین مطلب"
فرمت فایل: word (قابل ویرایش و آماده پرینت)
تعداد صفحات:25
2-1مواد لازم
2-1-1: نمونه
2-1-1-1: انتخاب نمونه: نمونه ها شامل تخم ، لارو ، کنه بالغ خونخورده و کنه نر بودند ، این نمونه ها از بخش تک یاخته شناسی – آزمایشگاه تحقیقات بند پایان موسسه رازی تهیه شده بودند ، نمونه ها مربوط به سه منطقه بوشهر ، کردان کرج و بوئین زهرا بودند.
نمونه های کنه بالغ خونخورده بعد از جمع آوری از صحرا به منظور تخم گذاری در آزمایشگاه در انکوباتور 26 درجه سانتیگراد و رطوبت 60 تا 70 درصد قرار داده شدند ، بعد از تخم گذاری ، مقداری از نمونه های تخم به منظور تهیه لارو در انکوباتور قرار داده شدند و سایر نمونه های تخم کنه در دمای 5 درجه سانتیگراد به منظور تحقیقات بعدی نگهداری شدند .
2-2 روش استخراج :
استخراج DNA ژنومی در این تحقیق با دو روش انجام گردید :
الف) استخراج DNA به روش فنل – کلروفرم به همراه پروتئیناز K
ب ) استخراج DNA به روش جذب برروی فیبرهای شیشه ( کیت)
2-2-1: مواد لازم برای استخراج DNA به روش فنل –کلروفرم به همراه پروتئیناز K (d oliveria et al .,1997)
- ازت مایع ، ازت مایع جهت انجماد و پودر کردن نمونه (تخم، کنه بالغ و لارو)بکارگرفته شد.
- محلول شماره 1 : این محلول جهت لیز و آزادسازیDNA از سلول های استفاده میشود،که حاوی ترکیبات زیر میباشد:
Tris-HCl 50mM
SDS 1%
NaCl 100mM
EDTA 50mM
pH این محلول درنهایت باید 8 باشد ، این محلول در تیوبهای کوچک تقسیم شده و در فریزر نگهداری می شود .
- محلول پروتئیناز K با غلظت 20mg /ml
- محلول شماره 2: محلول فنل – کلروفرم - ایزو آمیل الکل به نسبت ( 1: 24:25) می باشد .
- اتانول مطلق 96 درجه
- اتانول 75 درجه
- TE بافر که حاوی ترکیبات زیر می باشد :
10mM Tris – HCl ( pH:8)
1 mM EDTA (pH:8)
2-2-1-1: طرز تهیه محلول فنل – کلروفرم – ایزوآمیل الکل :
برای استفاده از فنل در استخراج DNA ، ابتدا باید pH آن را در بیش از 8/7 متعادل کرد ، زیرا DNA در pH اسیدی تمایل به ورود به فاز فنلی رادارد ، در کارهای مولکولی از فنل با درجه خلوص بالا استفاده می شود که بصورت تجاری وجود دارد . رنگ فنل درهنگام استفاده شفاف و بی رنگ باشد .
ابتدا فنل را در 68 درجه ذوب کرده و میزان 1/0 درصد آن هیدروکسی کینولین
(Hydroxy quinoline) اضافه می گردد . این ماده یک آنتی اکسیدان بوده و تا حدودی مانع فعالیت DNase شده و همچنین جاذب یونهای فلزی است . علاوه بر این با ایجاد رنگ در فنل ،هنگام استخراجDNA براحتی فاز ارگانیک را قابل تشخیص میکند،بعد از ذوب فنل با اندازه گیری حجم مساوی محلول 5/0مولار Tris با pH:8 اضافه میشود، این مرحله تا وقتی که pH فنل به حد دلخواه نرسیده باشد ، ادامه مییابد.پس از تنظیم pH فنل به میزان 1/0حجم آن از Tris با pH:8 روی آن نگه داشته و به مقدار 2/0 درصد به فاز آبی ، 2- مرکاپتواتانول اضافه می شود ، در نهایت به محلول فنل به نسبت 25 ( فنل) 24 (کلروفرم) 1 (ایزوآمیل الکل) اضافه می گردد و در بطری ریخته می شود ، این محلول در یخچال در دمای 5 درجه سانتیگراد به مدت یک ماه پایدار است .( Sambrook,2001)
مقاله استخراج DNA