دانلود پایان نامه باکتری

اختصاصی از کوشا فایل دانلود پایان نامه باکتری دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت:word(قابل ویرایش)

تعداد صفحات:80

فهرست مطالب:

عنوان
۱-چکیده
۲-مقدمه
۱-۲- کلیاتی درباره آنتروباکتریاسه ها
۱-۱-۲- تقسیم بندی
۲-۲-۱ اختصاصات عمومی انتروباکتریاسه ها
۱-۲-۲ جداسازی انتروباکتریاسه ها
جداسازی انتروباکتریاسه ها
جداسازی از مدفوع
جداسازی از خون
جداسازی از ادرار
کشتهای جداکننده اولیه
۳-۲ – تشخیص آنتروباکتریاسه ها
محیط KCN
محیطهای دی کربوکسی لاز
آزمایش متیل رد
آزمایش ایمویک
۴-۲- ساختمان آنتی ژنیک و پیچیدگی آنتی ژنیک
۱-۴-۲- آنتی ژنهای K
۲-۴-۲-آنتی ژنهای H
۳-۴-۲ آنتی ژنهای O
۵-۲- تغییرات و روابط ژنتیکی
۶-۲- شناسایی گروههای فامیل آنتروباکتریاسه ها
۱-۶-۲- جنس سالمونلا
۲-۶-۲-جنس آریزونا
۳-۶-۲- جنس سیتروباکتر
۴-۶-۲-جنس اشیگلا
۵-۶-۲-جنس اشریشیاها
۶-۶-۲-جنس ادواردسیلها
۷-۶-۲-جنس کلسیلا
۸-۶-۲-جنس انتروباکتر
۹-۶-۲-جنس هافینا
۱۰-۶-۲-جنس سراتیاها
۳- شناسایی جنس پروتئوس
۱-۳- عفونتهای پروتئوسی
۱-۱-۳- اپیدمیدلژی و پاتوژنیسته
۲-۱-۳- تظاهرات بالینی
۳-۱-۳- عفونتهای جلدی
۴-۱-۳- عفونتهای گوش و سینوسهای ماستوئید
۵-۱-۳- عفونتهای مجاری ادراری
۶-۱-۳- تشخیص
۸-۱-۳-درمان
۴-هدف
۵-مواد و روشها
۵-۱- کشت بر روی محیط SS
۵-۲-کشت بر روی محیط مکانیکی
۵-۳-کشت بر روی محیط Tsi
۵-۴-کشت بر روی محیط ژلوزساده
۵-۵- استفاده از تستهای اختصاصی (Api سیستم)
۱-۵-۵- آ‎زمایش اورتونیتروفنیل- بتا- د- گالاکتوزید
۲-۵-۵- آزمایش هیدورژن سولفوره
۳-۵-۵- آزمایش د آمیناز
۴-۵-۵- آزمایش اوره آز
۵-۵-۵- وژس پروسکائر
۶-۵-۵- آزمایش اندول
۷-۵-۵ آزمایش سیترات
۶-۵- مطالعات باکتریولژیکی
۶- نتایج
۷- بحث
۸ منابع و مآخذ

چکیده:

باکتری های این گروه میله ای شکل- گرام منفی – هوازی دارای آنزیم فنیل آلانین و آمیناز هستند. اکثراً دارای زندگی آزاد و غیر پاتوژه بوده و در آب- خاک – فاضلاب و بعضاً جزء فلورطبیعی رود می باشند. پرتئوس مورگانی P. Morgagvill و پروئوس پروویدا نس اساساً لاکتوز را تخیمیر نمی کنند و اگر این کار را انجام دهند بکندی بسیار خواهد بود. پروتئوس ها معمولاً اوره آزتولید می کنند که اوره را تجزیه نموده و ایجاد آمونیاک می نماید. طی عفونتهای اداری توسط پروتئوس ادرار شدیداً قلیایی می شود و تولید سنگهای اداری تسریع می گردد و اسیدی نمودن آن به سادگی میسر نیست. پروویدا نیسا ایجاد داوره آزا نمی کند

   پروتئوس ها به وسیله فلاژلهای پری تریش خود سریعاً متحرکند و معمولاً در سطح محیط های کشت جامد نیز به نحو خاصی جاری می شوند. جابجا و پخش شدن باکتر در محیط جامد به نام Swarming با هجوم خوانده می شود. برای جلوگیری از این پدیده (کته جدا کردن باکتری ها را تقریباً غیر ممکن می نماید). باید به محیط کشت مواد خاصی افزود (مثلاً فنیل اتیل الکل با محیط هائی مانند CLED که از نظر الکترولیت فقیر هستند باید مورد استفاده قرار گیرد). حرکت سریع باکتری در بخش و هجوم آن بدستگاه اداراری ممکن است سهیم باشد.

   پروتئوسها متحرک دارای آنتی ژن H هستد (علاوه بر آنتی ژن O ) بعضی از   پروتئوسها که به نام OX خوانده می شوند دارای آنتی ژنهای پلی ساکارید مشترکی با ریکتزیا ها می باشند. سرم بیماران متبلا به ریکتزی قادر به آلگوتینه کردن پروتئوس های OX می باشند. (که از آن تستی پایه گذاری شده تا به تشخیص ریکتزیوزکمک نماید و به نام تست واین وفلیکس Weil – Felix خوانده می شود.) پروتئوسها نیز ماننند کلی فرم ها هنگامی که از دستگاه گوارشی خارج گردند ایجاد بیماری می نمایند. باکتری اکثراً در عفونت های ادراری خارج گردند ایجاد بیماری می نمایند. باکتری اکثراً در عفونت های ادراری باکتریمی پنمونی و نیز عفونت های کانونی افراد ضعیف و رنجور مشاهده می شود. عفونی شدن از طریق تزریق داخل ویریدی نیز مشاهده شده است. از نظر حساسیت نسبت به داروهای مختلف تفاوت بسیاری بین سوشهای   پروتئوس وجود دارند.

   پنی سیلی اغلب بر روی پروتئوس میرابیلیس P. Mirabilis مؤثر است. انواع دیگر پروتئوس در حال حاضر(1982) نسبت به آمینوگیلکوزید ها (آمیکاسین، توبرامایسین و جنتا مایسین) سفالوسپرین ها (سفا ماندول و سفولوکسی تین) و کلرا مفنیکل حساس می باشند.

کلیاتی درباره انترباکتریاسه ها ENTEROBACTRIACEAE

   انتر باکتریاسه هافامیل بزرگ از باکتری ها هستند و بیشترین میکروبهای گرم منفلی هوازی یا بیهوازی اختیاری می باشند که در نمونه های آلوده بدن انسان یافت می شوند.

   یک بررسی جامع که توسط Blachman و Pikett در سال 1987 بر روی 768 نمونه میکروهای بدن افراد آلوده انجام گردیده نشان داده است که 78% آنها انتروباکتریاسه ها بوده اند. 12% از سود و موناسه ها، 9% از هموفیلو سلها و 1% از باسیلهای گرم منفی غیر معمولی مثل اکتینوباسیلوس بروسلا کاردیوباکتریوم، استرپتو باسیلوس.

نام انتروباکتریا سه ها بیشتر به خاطر این بر روی باکتریها گذاشته شده است که بیشترین آنها میکروبهای روده ای هستند، خیلی از این انتروباکتریاسه ها بدون هیچگونه عارضه در روده انسان وجود دارند و نه اینکه صدمه ای نمی زنند بلکه بعضاً مفید هم هستند. و در تخمیر مواد غذایی راخل روده کمک می کنند، اشریشیاکولی (E . Coli ). یکی از انواع انتروباکتریاسه ها است که 95 تا 99 درصد میکروبهای ساپروفیت روده را تشکیل می دهند، در یک گرم مدفوع تعدادی برابر 10¹¹ عدد از این باکتریها وجود دارند که به صورت بیهوازی اختیاری در روده زندگی می کنند. بیشتر بوی مدفوع مربوط به این باکتری و باکتری های دیگر مثل پروتئوس و میکروبهای گرم مثبت مثل بایفید و باکتریوم (Bifidobacterium) ولاکتوز باسیلهای بیهوازی می باشند.

تقسیم بندی انتروباکتریاسه ها:

CLASSIFICATION OF ENTEROBACTERIACEAE

بعد از دسته بندی که در سال 1974 در هشتمین جلسه

Bergy . S Manufal Of Determiniative , Bacteology.

انجام گردید نظریات گوناگون دیگر بر اساس اختصاصات کشف رد و بیوشیمایی باکتری ها داده نشد. و تقسیم بندی انتروباکتریاسه ها دچار تغییراتی مختلفی گردید و میکروبیولژیستها معتقدند که دچار سردرگمی گردیده اند خصوصاً که با عرضه شدن تقسیم بندی Edward and Ewing این مسئله شدت پیدا کرد تا این که در سال Center for disease control 1977 و نامگذاری آنها را پذیرفت و امروزه بیشتر دسته بندی انتروباکتریا سه را بر اساس آن انجام میدهند.

جدول تقسیم بندی ادوار و اوینگ:

   در این نوع تقسیم بندی فامیل انترباکتریاسه ها به سرگروههای (Speciels) و گروهها Ginous و انواع Tribe که به دنبال آن گاهی بیوتیپها (Biotypes) نیز قرار می گیرند.

فامیلی: انترو باکترویاسه ها

سرگروهها: اشریشیاها

جنس 1‍: اشریشیاها

گونه: اشریشیاکلی

جنس 2: شیگلا

گونه: (ش) دیسانتری

     ش، فلکس نری

     ش، پوویدی

   ش، سونئی

سرگروه 2: جنس ادوارسیلاها

جنس 1: ادار سیلاترادا

سرگروه 3: سالمونلاها

گونه: س، کلرا سیس

     س، تیغی

     س، انتریتیدی

جنس 2: آریزونا

گونه: هین شاوی

جنس 3: سیتر وباکتر

گونه: س، فرزند دای

   س، دایورسوس

سرگروه 4: کلیسیلاها

جنس 1: کلیسیلا

گونه: ک، پنومونیه

     ک، اکسی توکا

     ک، اوزابا

   ک، رینوسلکراماتیس

جنس 2: انتروباکتر

گونه: 1 کلواکا

     1، جرگوویا

     1، آگلومرت نز

   1، آئرجینواز

   1،سازاکیای

جنس 3: هافینا

گونه: هـ، آلوئی

جنس 4: سراتیا مارسه سنس

گونه : م، مورگانلا

سرگروه 6: ی، یرسینا

گونه: ی، یرسینا پستیس

     ی، انتروکوکسیتیکا

     ی، سود و توبرکولوزیس

   ی، فردریک سنیای

   ی، کریستانسیای

   ی، روکری

سرگروه 7: اروینیاها

جنس1: اروینیا

جنس 2: پکتوبا کتریوم

جنس کلوی ورا Kluy vera در سال 1981 توسط Farmer و دستیا را نش جز انترباکتریها سه ها قلمداد گردیده است که قبلاً به نام میکروبهای دوره ای گروه 8 (Enteric group) نامیده می شده است، این جنیوس بیشتربن اختصاصات شیمیایی انتروباکتریاسه ها را دارا می باشند، سه نوع از این جنیوس نامبرده شده که عبارتند از:

کلوی وار – آسکورباتا (k.ascabata ) کلوی ورا کرایو کرسنس (K . cryocrescents) کلوی ورا- کرایو کرستس (K . cryocrescents) و کلوی ورا گروه 3 (K. species – group)                                                                                                                                         نوع آسکارباتا از کرا یوکرسنس با + بودن آزمایش آسکوربات عدم رشد، در 5 درجه سانتی گراد در یخچال وزون کوچکتر در اطراف دیسک کار پنی سیلین و سفالوتین فرق گذاشته می شود.

نویسنده مقاله (Farmer) معتقد است که این باکتری جز با توژنهای فرصت طلب هستند و جنیوس دیگر اخیراً به آنتروباکتریا یا سه ها اضافه گردیده یکجا تاتوملا تایسئوس طیف وسیع در اطراف دیسک پینی سیلین و رغبت بودن داخل بعضی محیطها بعد از 7 روز و تعداد کم فلاژه در اطراف باکتری فرق دارد.

   این باکتری به آمینی سیلین – سفالو تین – تترا سکلین – کلر آمفنیکل – آمینو گلوسیدها حساس هستند. دیگری سداسیا Cedacea (نام از DCD) که از نمونه های مختلف بدن انسان جدا شده. ولی اختصاصات آنها ذکر نگردیده است. انواع آنها C.davisae , C.lapagel ذکر شده اند.

اختصاصات عمومی فامیل انتروباکتریاسه:

 اعضای خانواده انتروباکتریاسه ها گرم منفی و باسیلی شکل و مستقیم هستند که بیشتر آنها متحرک می باشند گرچه بعضی جنسها مثل کلسیلا و شیگلا غیر متحرک هستند) آنها پریتریکوس فلاژلاژ می باشند، (سود و موناسه ها که پولا رفلاژلا هستند). و چندین سویه مثل سالمونلاها شیگلاها انترو باکترپروتئوس دارای فیمبر یا پاپیلی هستند که عامل متحرک باکتری نبوده و هیچگونه خاصیت آنتی ژنتیک- باکتریهانمی دهند و فقط در زیر میکروسکپ الکتروسی دیده می شوند.

مقاله : اثر میزان چربی شیر بر رشد و فعالیت باکتری های آغازگر و کیفیت ماست معمولی

اختصاصی از کوشا فایل مقاله : اثر میزان چربی شیر بر رشد و فعالیت باکتری های آغازگر و کیفیت ماست معمولی دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

مقاله : اثر میزان چربی شیر بر رشد و فعالیت باکتری های آغازگر و کیفیت ماست معمولی ، ورد 13 صفحه

دارای منابع و یک صفحه خلاصه انگلیسی

بخشی از متن مقاله :

چکیده

اثر میزان چربی شیر در سطوح 1، 5/2 و 4% بر رشد و فعالیت باکتریهای آغازگر در طی زمان تخمیر و خصوصیات بافتی و حسی نمونه های ماست با ماده جامد کل 11% بررسی شد. صفات مورد بررسی در حین تخمیر شامل ‍pH ، اسیدیته و تعداد باکتریهای آغازگر ( استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس بولگاریکوس) و صفات مورد بررسی در محصول نهایی، شامل درصد آب اندازی و ارزیابی حسی بودند. آزمایشات در سه تکرار و تجزیه و تحلیل داده ها در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی انجام گرفت. بررسی آماری نتایج نشان داد که با افزایش سطح چربی از 1% به 4%، pH نمونه های ماست از 07/4 به 44/4 افزایش و اسیدیته از 8/0 به 66/0 کاهش یافته است. افزایش درصد چربی باعث تحریک رشد استرپتوکوکوس ترموفیلوس شده به طوری که با افزایش سطح چربی از 1% به 4% تعداد این باکتری از cfu/ml 106 × 226 بهcfu/ml 106× 395 افزایش یافت، در حالی که میزان چربی اثر مشخصی بر رشد باکتری دیگر (لاکتوباسیلوس بولگاریکوس) نداشت. افزایش درصد چربی از 1% به 4% باعث کاهش آب اندازی محصول از 36% به 27% شده ولی میزان پذیرش حسی محصول نهایی را کاهش داد.

کلمات کلیدی: ما ست، میزان چربی ، اسیدیفیکاسیون، باکتریهای آغازگر

مقدمه

ماست از پر مصرف‌ترین فرآورده‌های تخمیری شیر است، که به دلیل ارزش تغذیه‌ای بالا تأثیر مثبتی در سلامتی انسان و اهمیت ویژه‌ای در رژیم غذایی افراد دارد. در سالهای اخیر مقدار تولید ماست بسته‌بندی در کشور حدود دو ونیم برابر افزایش یافته است؛ به طوری که در سال 1376 تولید ماست در کشور حدود 26 هزار تن بوده است، در سال 1380 به میزان تقریباً 52 هزار تن افزایش یافته است . این رقم در سال 1381 حدود 63 هزار تن بوده است. (آمارنامه کشاورزی، امور دام و آبزیان،1380 )

خصوصیات ماست نظیر اسیدیته، میزان اسید چرب آزاد، ترکیبات ایجاد کننده عطر و طعم (دی استیل، استالدهید و استوئین) و همچنین خصوصیات حسی و ارزش تغذیه‌ای فاکتورهای مهمی در ارزیابی محصول می‌باشند. این فاکتور‌ها تحت تأثیر عواملی از قبیل ترکیب شیمیایی شیر، شرایط فرآیند، افزودنیها و فعالیت باکتریهای آغازگر در حین تخمیر قرار می‌گیرد ( تمیم و رابینسون[1] 1999،بونزر[2] و همکاران 2002). در ارتباط با تأثیر میزان چربی شیر روی خصوصیات فیزیکو شیمیایی و بافتی ماست، تحقیقات کمی صورت گرفته است (شیکر[3] و همکاران 2000، بونزر2 و همکاران 2002 ). نتایج همه این تحقیقات نشان می‌دهد که با افزایش درصد چربی اسیدیته محصول به طور مشخصی کاهش و خصوصیات بافتی بهبود می‌یابد (افزایش ویسکوزیته و کاهش آب اندازی[4]) . افزایش ویسکوزیته با افزایش چربی ممکن است به علت افزایش ماده جامد کل و در نتیجه افزایش سفتی[5] محصول باشد که در نهایت آب ‌اندازی محصول را کاهش می‌دهد (لابروپلوس[6] و همکاران 1984، تمیم و رابینسون1 1999 ).

شیکر و همکاران (2000) خواص رئولوژیکی ماست با 4 سطح چربی را در حین فرآیند تخمیر مورد مطالعه قرار داده و به این نتیجه رسیدند که افزایش چربی شیر باعث افزایش ویسکوزیته و کاهش قدرت تولید اسید توسط باکتریهای آغازگر می‌شود.

بونزر و همکاران (2002 ) در زمینه تأثیر میزان چربی و نوع باکتری آغازگر روی خصوصیات کلی ماست تهیه شده از شیر میش، مشاهده کردند که نوع استارتر روی خصوصیاتی نظیر pH، اسیدیته، میزان دی استیل، استالدهید و اسید چرب آزاد و همچنین خصوصیات حسی و سفتی مؤثر است در حالی که تأثیر مشخص چربی شیر فقط در مورد میزان اسید چرب آزاد مشخص و قابل مشاهده می‌باشد.

هدف از این تحقیق مطالعه تأثیر چربی شیر روی رشد و فعالیت باکتریهای آغازگر در حین تخمیر ماست و در نهایت تبیین ارتباط بین پذیرش حسی نمونه‌ها و تعداد و فعالیت هر کدام از باکتریها می‌باشد.

 

مواد و روشها

شیر پاستوریزه با چربی 5/2% از کارخانه شیر پاستوریزه توس تهیه شد. به منظور تنظیم درصد‌های چربی مورد نظر، از خامه هموژنیزه 30% چربی تولید کارخانه صنایع شیر پگاه خراسان استفاده شد. استارتر CH1 نوعDVS از شرکت کریستین هانسن[7] کشور دانمارک تهیه شده و مورد استفاده قرارگرفت. این استارتر مخلوطی از دو باکتری استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس با نسبت‌های مساوی بودکه به دلیل تولید سطوح بالایی از استالدهید و سایر ترکیبات طعم زا در طی تخمیر مورد استفاده قرار گرفت.

آماده سازی شیر

[1] Tamime and Robinson

[2] Bonczar

[3] Shaker

[4] Syneresis

[5] Firmness

[6] Labropoulos

[7] Christian Hansen

پایان نامه کلونینگ و بیان ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری E. coli جهش یافته و مقایسۀ خواص این آنزیم با نوع native آن

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه کلونینگ و بیان ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری E. coli جهش یافته و مقایسۀ خواص این آنزیم با نوع native آن دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:124

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد(M.Sc.)
گرایش میکروبیولوژی

فهرست مطالب:
چکیده ........................................................................................................................................................ 1
مقدمه ...........................................................................................................................................................3
فصل اول کلیات .................................................................................................................... 5
1-1-پیشینه تاریخی ................................................................................................................................... 6
1-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ........................................................................ 8
1-3-  آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ............................................................................................ 10
1-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو .................................................................................. 12
1-4-1  اثر ضد سرطانی .......................................................................................................................... 12
1-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان ..................................................................... 14
1-4-2-1 آنزیم طبیعی ............................................................................................................................ 14
1-4-2-2-آنزیم تغییریافته ...................................................................................................................... 16
1-5- فارماکوکنتیک ................................................................................................................................ 19
1-5-1- مقاومت دارویی ........................................................................................................................ 23
1-5-2-  تأثیر دارویی .......................................................................................................................... 25
1-6-سمیّت .......................................................................................................................................... 28
فصل دوم روش کار ......................................................................................................... 34
2-1- مواد و میکروارگانیسم ها .............................................................................................................35
2-2- کشت باکتری .............................................................................................................................. 35
2-3- اعمالUV  در زمان های مختلف ................................................................................................ 35
2-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ............................... 36
2-4-1- کشت کلنی ها ....................................................................................................................... 36
2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها ............... 37
2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها ......................... 38
2-5- استخراج  DNA......................................................................................................................... 40
2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج  DNA................................................................................ 40
2-5-2- استخراج DNA ژنومی .......................................................................................................... 41
2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)   ........................................................................................... 42
2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ................................................................................................. 43
2-8- خالص سازی محصول PCR .................................................................................................. 44
2-9- استخراج پلاسمید ................................................................................................................... 46
2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ............................................................... 47
2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll ....................................................................... 47
2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ........................................................................ 48
2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll  .................................. 48
2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید .............................................................. 49
2-12-انتخاب کلون های مثبت ....................................................................................................... 50
2-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی .............................................................. 51
2-13-1-PCR ................................................................................................................................ 51
2-13-2- هضم آنزیمی ................................................................................................................... 52
2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll ............................... 53
2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز  ll..................................................................... 53
2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll  و ال-آسپاراژیناز l .............................. 54
2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-
PAGE  ............................................................................................................................................. 55
 2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ............................... 58
2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ........................................................ 59
2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژیناز  .................................................. 62
2-19- کشت سلول انسانی  ............................................................................................................. 62
2-19-1- تهیه محیط کشت RPMI1640 ..................................................................................... 63
2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های
سرطانی انسانی  ............................................................................................................................... 63
2-20-1- MTT Assay ................................................................................................................ 63
2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ........................ 65
فصل سوم نتایج ........................................................................................................... 67
3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها ........................................................................................... 68
3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490 ............... 69
3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش
 یافته ................................................................................................................................................ 70
3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll  ...................................................................... 72
3-5- تعیین توالی قطعه ژنی l-aspsraginase ll  ....................................................................... 74
3-6- وارد کردن قطعه ژنی l-asparaginase ll  در وکتور pET23a و تأیید آن ...................... 76
3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد .............................. 79
3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU)  ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز
 استاندارد ......................................................................................................................................... 80
3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-
آسپاراژیناز استاندارد ........................................................................................................................ 82
3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و
 ال-آسپاراژیناز استاندارد ................................................................................................................. 84
3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول
 های سرطانی HeLa  ...................................................................................................................... 85
3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول
 های سرطانی LCL   ....................................................................................................................... 89
3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ..................... 97
فصل چهارم بحث و پیشنهادات .................................................................................. 98  
منابع ............................................................................................................................................... 108

 
 چکیده
ال- آسپاراژیناز آنزیمی است که موجب هیدرولیز آسپاراژین به اسید آسپاراتیک و آمونیاک می شود . نام دیگر آن ال-آسپار است . این آنزیم امروزه جهت درمان بیماری سرطان خون و برخی تومور ها استفاده می شود. بطور کلی سلولهای سرطانی قادر به سنتز اسید آمینه غیر ضروری آسپاراژین نیستند در حالی که سلولهای نرمال خودشان این اسید آمینه را می سازند لذا سلولهای سرطانی نیازمند به مقادیر بالا از آسپاراژین در حال گردش می باشند . ال- آسپاراژیناز با تجزیۀ ال-آسپاراژین مانع از دسترسی سلولهای سرطانی به منابع این اسیدآمینه می شود . مهمترین اثر جانبی این دارو حالت آلرژی یا واکنش افزایش حساسیت است . هدف ما از این تحقیق 1- تهیه پروتئین آنزیم ال-آسپاراژیناز از باکتری جهش یافته E. coli  . 2- تاثیر این پروتئین بر روی یک رده سلولی سرطانی به منظور ارزیابی فعالیت آن و 3- دستیابی به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر ، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر بوده است. لذا به منظور رسیدن به اهداف فوق مراحل آزمایشگاهی زیر انجام شد: 1- قرار دادن باکتری E. coli در معرض نور UV . 2- تخلیص  DNA و انجام PCR به منظور تکثیر ژن آنزیم. 3- قرار دادن سکانس در داخل پلاسمید  pET23a(+)  و انتقال به E. coli. 4- خالص سازی پروتئین و تعیین مقدار آن. 5-  تاثیر بر روی یک لاین سرطانی و تعیین مقدار تاثیر آن. به این ترتیب بعد از ایجاد جهش و سنجش میزان تولید و فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز در کلنی های جهش یافته و تخلیص و تکثیر ژن این آنزیم از باکتری هایی که ال-آسپار را بیش از حد معمول تولید می کردند، محصول PCR این ژن ها برای تعیین توالی ارسال گردید و پس از تعیین توالی و مطابقت با بانک ژن بین المللی ncbi ، سکانس قطعه ژنی ال-آسپاراژیناز II  از باکتری E. coli KIAU B1 به عنوان یک سکانس جدید در بانک ژن با کدGenBank: HQ116626.1  به ثبت رسید. ژن مذکور در وکتورpET23a(+)   کلون و سپس پلاسمید نوترکیب حاصل در سلول های E. coli BL21 ترانسفر شد. . از سلول های ترانسفر شده ،پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز استخراج شد و پس از سنجش این پروتئین آنزیمی با تست های نسلریزاسیون و برادفورد، میزان فعالیت آنزیمی(IU)  و پروتئین کلّی(mg) آن مشخص و با نمونۀ استاندارد مقایسه شد. همچنین از نظر تأثیر بر سلول های سرطانی HeLa و LCL  ، با نوع استاندارد قیاس شد. نتایج نشان داد که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز نوترکیب برابر باIU/mg  178 می باشد، در حالی که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز استانداردIU/mgr  77 به دست آمد. همچنین، آنزیم نوترکیب علاوه بر آن که از نظر سکانس و قدرت آنزیمی با نوع استاندارد تفاوت  نشان می دهد ، نسبت به آن به نحو موثرتری بر رده های سلولی سرطانی  HeLa و LCL  تاثیر می گذارد.
 

مقدمه
با توجه به شیوع روز افزون انواع سرطان به عنوان یکی از مهمترین بیماری های تهدید کنندۀ سلامت انسان، دستیابی به روش های موثرتر در درمان سرطان به ویژه انتخاب ترکیبات دارویی با عوارض جانبی کمتر بیش از گذشته مورد توجه محققین قرار گرفته است.
آنزیم ال-آسپاراژیناز به صورت اختصاصی اسیدآمینه ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیاک کاتالیز کرده و نقش مهمی را در متابولیسم همه ارگانیسم های زنده و نیز در داروشناسی بازی می کند(2). دو نوع ترکیب از ال-آسپاراژیناز وجود دارد : ال-آسپاراژیناز l، یک آنزیمconstitutive  داخلی، و ال-آسپاراژیناز ll، یک آنزیم خارجی می باشد. این دو آنزیم از لحاظ بیوشیمیایی و ساختار ژنتیکی متفاوتند. ال-آسپاراژیناز ll به صورت گسترده در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی وجود دارد و بیش از پنج دهه مورد مطالعه فراوان قرار گرفته است(66). این آنزیم از منابع گوناگون مانند سلول های گیاهی و حیوانی، قارچ ها، مخمرها و باکتری ها جدا شده است(61).
ال-آسپاراژینازll  یک عامل شیمی درمانی مهم می باشد که برای درمان نوعی از اختلالات لنفوپرولیفراتیو و لنفوما، به ویژه لوکمی لنفوبلاستیک حاد یا ALL  بکار برده می شود. این آنزیم بخش اصلی ترکیب پروتوکل های شیمی درمانی است که در درمان ALL  اطفال به مدت تقریباً 30  سال استفاده می شود (6،5،4،3،2،1). بر این اساس، همچنین این آنزیم در جدیدترین رژیم های درمانی چند عاملی برای ALL  بالغین قرار دارد (8،7). ال-آسپاراژیناز به عنوان یک دارو، اثربخشی خود را در درمان و مراحل بعدی استراتژی های مختلف شیمی درمانی اثبات کرده است. بزرگ ترین محدودیت استفاده از ال-آسپاراژیناز حساسیت شدید بالینی در دز اثر بخشی است، که در 78-3 درصد بیماران تحت درمان با فرم های اصلاح نشده آنزیم ظاهر می شود (11،10،9،3). با گذشت بیش از 10 سال به نظر می رسد پگ-ال-آسپاراژیناز به عنوان یک ترکیب جانشین برای ال-آسپاراژیناز ، مشکلات ناشی از انواع ترکیبات طبیعی را اصلاح کرده است (13،12). در این تحقیق سعی بر این شد تا با ایجاد جهش در باکتریKIAU  E. coli ، ارزیابی میزان تولید آنزیم ال-آسپاراژینازll  در سویه جهش یافته، و دستیابی به ترتیب توالی جدید در ژن این آنزیم و کلون کردن آن، بتوان ال-آسپاراژینازی استخراج کرد که از نظر فعالیت ویژه و اختصاصیت در سطح بالاتری نسبت به نوع استاندارد قرار داشته باشد. همچنین با تاثیر این پروتئین آنزیمی بر رده سلولی سرطانی و ارزیابی فعالیت و درصد کشندگی آن بر این سلول ها، بتوان به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر دست یافت.

فصل اول
کلیات

1-1-پیشینه تاریخی
نظریه اولیه که به منظور گسترش ال-آسپاراژیناز به عنوان یک عامل بالقوه آنتی نئوپلاستیک ثابت شد بسیار با اهمیت بوده و توسط Clementi  در سال 1922 طرح شد(20). وی آشکار ساخت که  فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز در سرم خوکچه هندی دیده می شود. فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز فقط در سرم خوکچه هندی مشاهده می شد، درحالیکه در سایر پستانداران این آنزیم یافت نمی شد. در سال 1953، Kidd عود لنفوماهای پیوندی در موش ها و رت ها را با خوکچه هندی مقایسه کرد و شرح داد(39). این فعالیت سایتوتوکسیک در سرم اسب یا خرگوش وجود نداشت. Neuman و McCoy  در سال 1956 این نظریه ها را گسترش دادند(45). آنها ثابت کردند که رشد لاین سلولی که از کارسینوسارکومای Walker مشتق شده مستلزم ال-آسپاراژین است. Haley در سال 1961 با استفاده از لاین سلولی مربوط به لوکمی موش نتایج مشابهی بدست آورد (29). و بالاخره Broome بود که در سال 1961 درحالیکه در آزمایشگاه Kidd کار می کرد ، یافته های Kidd مربوط به مهار رشد را با اولین نظریه که توسط Clementi ارائه شد مقایسه کرد و با موفقیت نتیجه گرفت که فعالیت آنتی لنفوما در سرم های خوکچه های هندی ناشی از ال-آسپاراژیناز موجود در سرم این حیوان می باشد (12).  تحقیقات بیشتر این شخص خصوصیت نهفته درمانی این آنزیم را تایید کرد (12،11). Yellin   وWriston   در سال 1966، موفق به خالص سازی جزئی دو ایزوفرم ال-آسپاراژیناز از سرم خوکچه هندی شدند (63). بطور قابل توجه ، فقط یک ایزوفرم در شرایط in vivo  فعالیت آنتی لنفوما را آشکار می ساخت (64،63) .
از آنجاییکه استخراج این آنزیم به مقادیر کافی از سرم خوکچه هندی مشکل بود ، سایر منابع نظیر میکروبها بررسی شدند. Mashburn و Wriston ، در سال 1964  و Campbell و Mashburn در سال 1969 از خالص سازی ال-آسپاراژیناز E. coli  خبر دادند، و ثابت کردند که فعالیت تومورکشی آن شبیه به نوع سرمی خوکچه هندی می باشد(64،15).  این یافته ها پایه عملی تولید آنزیم با مقادیر زیاد را برای تحقیقات بالینی و پیش بالینی فراهم کرد(17،16،15) . Oettgen در سال 1967 اولین کسی بود که تأثیر ال-آسپاراژیناز در انسان های مبتلا به لوکمی را نشان داد (46). بطور همزمان بررسی مهم دیگری توسط Old  انجام شد که فعالیت آنتی توموری این آنزیم را در شرایط in vivo در یک مدل سگی مبتلا به لنفوسارکوما  اثبات می کرد(47).
درمان  با استفاده از پروتئین ها در انسان ها محدودیت دارد زیرا منجر به ایمنی زایی دارو می شود که مشکلی اساسی می باشد. واکنش های حساسیت شدید نسبت به ال-آسپاراژیناز E. coli  بطور متوسط عمومیت دارد. یک بررسی هم زمان بر روی ال-آسپاراژیناز E. coli و Erwinia carotovora  فقدان واکنش تقاطعی را نشان می دهد (24). هرچند هردو آنزیم به میزان زیادی  سبب تحریک سیستم  ایمنی می گردند. تلاش ها در این زمینه موجب کاهش ایمنی زایی این دارو ها شده است و این در حالیست که فعالیت آنزیمی آن حفظ شده است. مشخص شده است اتصال این آنزیم به  پلی اتیلن گلایکل یا PEG  به عنوان یک پردازش، واکنش های ایمنی زایی این دارو را از بین می برد بدون آنکه در ویژگی آنتی نئوپلاستیک آن تغییر ایجاد کند(27). این ترکیب اصلاح شده دارو در مدل های حیوانی باعث کاهش تشکیل آنتی بادی در مقایسه با ترکیب بومی آن می شود، و بطور محسوس مدت اثرش را طولانی می کند(57،27). در سال های اخیر، استفاده از ال-آسپاراژیناز در درمان لوکمی و سایر اختلالات لنفوپرولیفراتیو بطور وسیع افزایش یافته است. در اوایل از آن تنها برای  بهبود  بیماران مبتلا به ALL استفاده می شد (36،35،34،33،32،31،30،2،1)؛ اما پس از  تحقیقات اخیر به منظور تقویت درمان بدخیمی های لنفوئید، عملکرد این آنزیم را به مدت 30-20 هفته تجویز می گردد(57) . به این دلایل است که ال-آسپاراژیناز به عنوان یک جزء ضروری در روش های نوین شیمی درمانی چند دارویی قرار گرفته است.

پایان نامه بررسی باکتری های احیاء کننده سولفات در عفونت های روده بزرگ و آپاندیسیت

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه بررسی باکتری های احیاء کننده سولفات در عفونت های روده بزرگ و آپاندیسیت دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:87

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی  (M.A)
گرایش: میکروبیولوژی

فهرست مطالب:
عنوان                                               شماره صفحه
چکیده    1
فصل اول: کلیات تحقیق
مقدمه    3
1-1- مورفولوژی روده بزرگ    4
1-1-1 سکوم و آپاندیس    4
1-1-2 کلون    5
1-2- بیماری¬های روده بزرگ    6
1-2-1 آپاندیسیت    6
1-2-2 عفونت¬های داخل شکمی    7
1-2-3 بواسیر    7
1-2-4 سرطان روده بزرگ    7
1-3- فلورروده    8
1-4- نقش¬های مهم فلور طبیعی روده    10
1-5- تاثیر آنتی بیوتیک¬ها برروی فلور روده    12
1-6- علایم خارج شدن توازن باکتری¬های روده    13
1-7- پروبیوتیک¬ها    13
1-8- منافع مصرف پروبیوتیک¬ها    13
1-9- اشکال پروبیوتیک¬ها    14
1-10- پری بیوتیک¬ها    14
1-11- باکتری¬های بی¬هوازی احیاکننده سولفات    15
1-12- نقش باکتری¬های احیا کننده سولفات در طبیعت    15
1-13- نقش باکتری¬های احیا کننده سولفات  در صنعت نفت    16
1-14- خوردگی میکروبی    16
1-15- واکنش¬های احیای ترموشیمیایی سولفات    17
1-16-  سیستم¬های آلوده به SRB    17
1-17- اهداف، فرضیات و پرسش اصلی پژوهش    18
1-17-1 اهداف اصلی    18
1-17-2 اهداف اختصاصی    18
1-17-3 اهداف کاربردی    18
1-17-4 فرضیات پژوهش    18
1-17-5 پرسش اصلی پژوهش    18
فصل دوم: پیشینه پژوهش
2-1- پژوهش¬های انجام گرفته در سطح جهان    20
2-2- پژوهش¬های انجام گرفته در ایران    23
فصل سوم: روش شناسی تحقیق
3-1- مواد و روش کار    25
3-2- محیط کشت مورد نیاز    26
3-3- انتخاب بیماران مورد نظر برای نمونه¬برداری    26
3-4- ارزیابی تاثیر آنتی بیوتیک ها برروی باکتری¬های  SRB    30
3-4-1 آنتی بیوتیک کلیندامایسین    30
3-4-2 آنتی بیوتیک جنتامایسین    31
3-4-3 آنتی بیوتیک مترونیدازول    31
3-5- ارزیابی خواص ضدمیکروبی آنتی بیوتیک¬ها بر باکتری¬های SRB مثبت    32
3-6- تعیین هویت مولکولی باکتری¬های SRB مثبت    33
3-7- آنالیز آماری    33


فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق
4-1- مقدمه    35
4-2- تجزیه و تحلیل نتایج جمعیت شناختی    35
4-2-1 جنسیت    36
4-2-2 سن    37
4-2-3 میزان تحصیلات    38
4-2-4 میزان درآمد    39
4-3- ارزیابی فرضیات پژوهش    40
4-3-1 فرضیه اول    40
4-3-2 فرضیه دوم    43
4-3-3 فرضیه سوم    45
4-3-4 فرضیه چهارم    47
4-3-5 فرضیه پنجم    48
4-3-6 فرضیه ششم    50
4-4- نتایج آزمایش  PCR    54
4-4-1 تأیید استخراج DNA    54
4-4-2 تأیید PCR ژن16S rRNA    55
4-4-3 توالی تعیین ترادف شده قطعه 16S rRNA    56
4-4-4 آنالیز فیلوژنتیکی    57
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1- بحث    63
5-2- نتیجه گیری    67
5-3- پیشنهادات    67
منابع و مآخذ    68
فهرست منابع فارسی    68
فهرست منابع انگلیسی    70
چکیده انگلیسی    73



فهرست جداول
عنوان                                               شماره صفحه
جدول 3-1: پرسشنامه مورد استفاده در این پژوهش    25
جدول 3-2: ترکیبات محیط کشت API    26
جدول 3-3: خصوصیات بالینی افراد انتخاب شده برای نمونه-برداری    28
جدول 4-1: توزیع فراوانی و افراد بر حسب جنسیت    36
جدول 4-2: فراوانی افراد مورد پژوهش بر حسب گروههای سنی    37
جدول 4-3: توزیع فراوانی و در پاسخ دهندگان بر حسب میزان تحصیلات    38
جدول 4-4: فراوانی افراد مورد پژوهش بر حسب میزان درآمد    39
جدول 4-5: فراوانی افراد مورد پژوهش بر حسب گروه های سنی و بیماری    40
جدول 4-6: ضریب همبستگی متغیرهای سن افراد و بیماری    42
جدول 4-7: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس درامد و بیماری    43
جدول 4-8: ضریب همبستگی متغیرهای سن افراد و بیماری    44
جدول 4-9: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس سابقه بیماری و بیماری    45
جدول 4-10: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس جنسیت و سابقه مصرف آنتی¬بیوتیک    47
جدول 4-11: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس گروه سنی و تحصیلات    48
جدول 4-12: ضریب همبستگی متغیرهای تحصیلات افراد و بیماری    49
جدول 4-13: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس گروه های سنی وتاثیر آنتی¬بیوتیک¬ها    50
جدول 4-14: ضریب همبستگی متغیرهای سن و تاثیر داروی    51
جدول 4-15: ضریب همبستگی متغیرهای سن و تاثیر داروی جنتامایسین    52
جدول 4-16: ضریب همبستگی متغیرهای سن و تاثیر داروی مترونیدازول    53

 
فهرست نمودارها
عنوان                                               شماره صفحه
نمودار 4-1: فراوانی و نسبت افراد مورد پژوهش بر حسب جنس    36
نمودار 4-2: توزیع درصد نمونه آماری افراد برحسب سن    36
نمودار 4-3: فراوانی افراد مورد پژوهش  بر حسب میزان تحصیلات    38
نمودار 4-4: توزیع در صد نمونه آماری افراد  بر حسب میزان درآمد    39
نمودار 4-5: نمودار توافقی سن و بیماری آپاندیسیت    41
نمودار 4-6: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس آپاندیسیت    41
نمودار 4-7: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس درامد و بیماری    43
نمودار 4-8: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس سابقه بیماری و بیماری آپاندیسیت    46
نمودار 4-9: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس سابقه بیماری و بیماری عفونت روده    46
نمودار 4-10: فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس جنسیت و سابقه مصرف آنتی¬بیوتیک    47
نمودار 4-11:  فراوانی افراد مورد پژوهش بر اساس گروه سنی و تحصیلات    48
نمودا 4-12: ارزیابی تاثیر کیفی داروی کلیندامایسین بر باکتری¬های احیا کننده سولفات جدا شده از گروه¬های سنی    51
نمودار 4-13: ارزیابی تاثیر کیفی داروی جنتامایسین بر باکتری های احیا کننده سولفات جدا شده از گروه های سنی    52
نمودار 4-14: ارزیابی تاثیر کیفی داروی مترونیدازول بر باکتری¬های احیا کننده سولفات  جدا شده از گروه¬های سنی    53

 
فهرست شکل ها
عنوان                                               شماره صفحه
شکل 1-1: آپاندیس ملتهب و متورم (آپاندیسیت)    6
شکل 1-2: فلور طبیعی روده    10
شکل 3-1: مرحله جداکردن زائده آپاندیس    27
شکل 3-2: تلقیح باکتری¬های SRB)) به محیط مایع API    30
شکل 3-3: تاثیر آنتی بیوتیک¬ها بر رشد باکتری های SRB    32
شکل 4-1: تصویر الکتروفورز حاصل از DNA استخراج شده از باکتری.    54
شکل 4-2: تصویر الکتروفورز حاصل از تکثیر ژن 16S rRNA باکتری.    55


 
چکیده
باکتری¬های احیا کننده سولفات (SRB) گروه بزرگی از میکروارگانیسم¬های بی¬هوازی هستند که نقش بسیار مهمی در بسیاری از فرآیندهای بیوژئوشیمیایی ایفا می¬کنند. این پژوهش با هدف شناسایی وتعیین هویت مولکولی باکتری¬های احیا کننده سولفات و نقش آن¬ها در عفونت¬های روده بزرگ و آپاندیسیت در شهر کرمان انجام شد. روش کار: این پژوهش به صورت مقطعی-توصیفی در سال 1391 تا 1392 بر روی 50 بیمار مراجعه کننده به بیمارستان¬های مختلف شهر کرمان انجام شد. تمامی افراد مورد بررسی دارای مشکلات عفونت روده بزرگ ویا آپاندیسیت بودند. در بین این افراد نمونه¬گیری از حفره شکم و روده ی بزرگ انجام شد. سپس نمونه¬های تهیه شده به محیط کشت اختصاصی API تلقیح و 2 ماه در دمای 35 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند. سپس نمونه¬های مثبت پس از کشت مجدد در محیط جامد اختصاصیSRB ، برای خالص سازی بیشتر به محیط جدید API  منتقل گردید. شناسایی مولکولی جدایه ها با استفاده از پرایمر یونیورسال  16s rRNA و مقاومت آنتی بیوتیکی صورت گرفت. از مجموع نمونه¬های مورد پژوهش از6 مورد (12%) نمونه¬های مشکوک به SRB جداسازی گردید. اما با روش مولکولی در4 مورد (8%) باکتری های احیا کننده سولفات شناسایی شد. بیشترین گونه ی باکتری¬های (SRB) مربوط به سویه Desulfovibrio piger بود. همچنین بین جداسازی باکتری¬های SRB، سن و میزان تحصیلات افراد ارتباط معنی¬داری مشاهده شد مناسب¬ترین آنتی¬بیوتیک برای حذف باکتری¬های SRB کلیندامایسین شناسایی شد. با توجه به نقش احتمالی باکتری¬های SRB در  ایجاد سرطان کلون و عفونت¬های روده¬ای، ضرورت انجام پژوهش¬های تکمیلی و پایش مداوم بالینی در جمعیت¬های گسترده تر و ارزیابی نقش بیوسایدها وآنتی¬بیوتیک¬ها در حذف این باکتری¬ها وجود دارد.

واژگان کلیدی: باکتری¬های احیا کننده سولفات، عفونت¬های روده بزرگ، 16s rRNA



فصل اول:
کلیات تحقیق

مقدمه
باکتری¬های احیا کننده سولفات SRB به طور وسیعی در اقیانوس، آب¬های شیرین، لجن¬ها پراکنده¬اند. این باکتری¬ها از سولفات به عنوان پذیرنده نهایی الکترون استفاده و سولفید هیدروژن تولید می¬نمایند. تا اکنون 14 جنس از این گروه باکتری¬ها شناخته شده که به جز دسولفونما ویبرو تمامی آن¬ها گرم منفی می¬باشند. یک جنس از این باکتری¬ها به نام دسولفوویبرو می¬تواند در هنگام تکثیر فعال خود بیش از 10 گرم در لیتر سولفید هیدروژن تولید نماید (آبیارد 1382، 12-11؛ ;Geneva 2001, 157 Collette 1999, 198 ).
باکتری¬های SRB نقش مهمی را در شروع التهاب یا التهاب¬های دائمی از قبیل بیماری¬های دندان  ایفا     می¬کنند (;Langendijk 2000, 943-950 loubinoux et al 2003, 1304-1306 ). Desulphovibrio spp از آبسه¬های شکمی و آبسه¬های مغزی و همچنین از خون و ادرار نیز جدا شده¬اند (Collette 1999, 198). باکتری¬های SRB انرژی مورد نیاز خود را از احیای سولفات بدست می¬آورند این باکتری¬ها به دلیل تولیدH2s  که بجز ترکیبات سیتوتونیک  مهم است و یک عامل خورنده  می¬باشد (Barton 2007, 1-523) و در مجاری دستگاه گوارش (دهان و روده) انسان و حیوانات وجود دارند. یکی از آرکی متانوژنیک (متانوژن) به نام متانو بروی باکتراسمیتی  در عفونت¬های انسانی یافت شده است (Worden and Smelly 1996, 157-171 ) مهم ترین باکتری¬های احیاکننده سولفات شناسایی شده در فلور روده عبارتند از:
دسولفوتوماکولوم ، دسولفوویبریو ، دسولفوبولبوس ، دسولفوفیرفیلدنیس ، دسولفوویبریوپیگر  (Goldstein 2003, 2752-2754؛ La Scola and Raoult 1999, 3076-3077 ، Susceptibilities of  23 Desulfovibrio Isolates from Humans, 5308–5311 ).
براساس مطالعات Birvin در سال 2001 در کشور کانادا شیوع مشکلات گوارشی همراه با درد 6% گزارش کرد و در سال 2003 Ehlin و در سال 2004 Wilson در انگلستان شیوع عفونت را به ترتیب 2/8 درصد و 5/10 درصد گزارش کردند که از سال 1970 تا 2004 به طرز چشمگیری افزایش پیدا کرده است. Hugin در سال 2005 و Boivin در سال 2001 در ایالات متحده امریکا عفونت روده در بین دانش آموزان و در محدوده سنی بین 16 تا 30 سال در مردان 65 درصد و در زنان 44 درصد گزارش کردند.
در سال 1992، John، Boseph و همکاران ثابت کردند که منوباکتام¬ها (آزترونام) یا آمینوگلیکوزیدها به همراه کلیندامایسین یا مترونیدازول در کاهش (Intra abdominal infections) موثر می¬باشند (Yoshiota et al 1991, 11-17 ).
آنتی¬بیوتیک کلیندامایسین از دسته داروهای پادباکتری با نیمه عمر 2 تا 3 ساعت مانع از بیوسنتزپروتئین توسط باکتری می¬شود که در درمان پریتونیت، عفونت¬های داخل شکمی و همچنین عفونت¬های استافیلوکوکی مصرف می¬شود. مترونیدازول یکی از داروهای نیتروایمیدازول اثر کشندگی بر باکتری¬های  بی¬هوازی و پروتوزوآها دارد از این رو در درمان بیماری¬های التهابی، کولیت پسودو ممبراند و عفونت¬های ژیادریایی مصرف می¬شود (منصور 1390، 36-35؛ گوهرخانی 1374، 27؛ سیمون 1368، 18-17).
هدف از این پژوهش، ارزیابی نفش باکتری¬های احیا کننده سولفات در ایجاد عفونت¬های روده بزرگ و آپاندیسیت در شهر کرمان می باشد.

1-1- مورفولوژی روده بزرگ
روده بزرگ به طول 1.4 تا 1.8 متر، از انتهای روده باریک شروع شده و به مجرای مقعد ختم می¬شود. ابتدای روده¬ی بزرگ که در ارتباط با ایلئوم قراردارد، سکوم یا روده کور نامیده می¬شود. قسمتی ازروده بزرگ که بین سکوم وآنال کانال قراردارد، کولون نامیده می¬شود که به سه قسمت کولون مساعد، کولون افقی وکولون نازل، تقسیم می¬گردد. کولون نازل درانت ها به سیگموئیدورکتوم و نهایتاً آنال کانال، ختم می¬شود (جان ای 1389، 90-89).
1-1-1 سکوم و آپاندیس  
سکوم قسمت ابتدایی روده بزرگ است که زاییده آپاندیس به قسمت بن بست آن متصل می¬شود. آپاندیس زایده¬ی انگشت مانندی است به طول 10-5 سانتی¬متر وقطر متوسط 8/0 سانتیمتر که با افزایش سن قطر آن کاهش می¬یابد. دیواره آپاندیس مرکب از 4 لایه¬ای است که درسایر قسمت¬های لوله گوارش یافت          می¬شود. مخاط آپاندیس شبیه روده بزرگ، فاقد پرز وچین و حاوی غدد لوله¬ای مستقیم است. اپیتلیوم پوشاننده آن شامل سلول¬های جذب¬کننده و جامی است. آستروزیر مخاط حاوی تعداد زیادی عقده¬های لنفاوی است که با افزایش سن ازتعداد آنها کاسته می¬شود. در افراد سالخورده با ناپدیدشدن بافت لنفاوی درآپاندیس، مخاط وزیرمخاط فیبروزه میشوند. طبقه عضلانی در آپاندیس شبیه روده کوچک، مرکب از عضلات حلقوی درداخل وعضلات طولی درخارج است که از خارج بوسیله بافت سروز پوشیده شده است. آپاندیس یک عضو لنفاوی است و مانند دیگربافت¬های لنفاوی میتواند ملتهب شده وتولید آپاندیسیت نماید (جان ای 1389، 90-89).

پایان نامه مطالعه ی باکتری های بی هوازی هالوفیل احیا کننده نیترات مولد بیوسورفکتانت از نفت خام ایران

اختصاصی از کوشا فایل پایان نامه مطالعه ی باکتری های بی هوازی هالوفیل احیا کننده نیترات مولد بیوسورفکتانت از نفت خام ایران دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)

تعداد صفحات:81

فهرست مطالب:

فصل اول
کلیات
1-1 مقدمه .............................................................................................................................. 2
2-1 پیدایش نفت .................................................................................................................. 4
1-2-1 نظریه منشأ معدنی ..................................................................................................... 4
1-2-1 نظریه منشأ آلی ......................................................................................................... 4
 1-3 نفت خام ....................................................................................................................... 5
1-4 انواع نفت خام ............................................................................................................... 5
1-5  خام برنت ...................................................................................................................... 6
1-6 نفت خام مارس .............................................................................................................. 6
1-7 نفت خام میناس ............................................................................................................. 6
1-8 نفت خام موربان ............................................................................................................ 7
1-9 نفت خام تاپیس ............................................................................................................ 7
1-10 اجزای نفت خام ......................................................................................................... 7
1-11 خواص نفت خام ........................................................................................................ 9
1-11 -1 خواص فیزیکی نفت خام ..................................................................................... 9
1-11-2  شیمیایی نفت خام ................................................................................................ 10
1-12 باکتری های بی هوازی ............................................................................................. 10
1-13 دسته بندی باکتری های بی هوازی ........................................................................... 11
1-13-1 باکتری های بی هوازی احیاکننده نیترات ........................................................... 11
1-14 اندامگان بی هوازی ................................................................................................... 11
1-15 متابولیسم بی هوازی .................................................................................................. 12
1-16 بیوسورفکتانت ........................................................................................................... 13
1-17 تعریف بیوسورفکتانت ها ......................................................................................... 13
1-18 بیوسورفکتانت ها از نظر وزن مولکولی ................................................................... 13
1-18-1 بیوسورفکتانت های با وزن مولکولی پایین .......................................................... 13
1-18-2 بیوسورفکتانت های با وزن مولکولی بالا ............................................................. 14
1-19 تولید بیوسورفکتانت ها ............................................................................................. 14
1-20 اثر فاکتورهای مختلف بر تولید بیوسورفکتانت ........................................................14
1-20-1 اثر منبع کربن بر تولید بیوسورفکتانت ..................................................................15
1-20-2 اثر منبع نیتروژن بر تولید بیوسورفکتانت .............................................................. 15
1-20-3 اثر فاکتورهای محیطی بر تولید بیوسورفکتانت .................................................... 15
 1-21 تقسیم بندی بیوسورفکتانت ها .................................................................................  16
1-22 انواع بیوسورفکتانت ................................................................................................... 16
1-23 مزیت های استفاده از بیوسورفکتانت ......................................................................... 17
1-24 مزیت بیوسورفکتانت ها به سورفکتانت های شیمیایی .............................................. 18
1-25 کاربردهای بیوسورفکتانت ها ..................................................................................... 19
1-25-1 کاربردهای بیوسورفکتانت ها در صنعت نفت ....................................................... 19
1-25-2 کاربردهای بیوسورفکتانت ها در صنایع غذایی .................................................... 20
1-26 نقش های طبیعی و فیزیولوژیکی بیوسورفکتانت ها .................................................. 20
1-27 افزایش سطح تماس ناحیه هیدروفوبی سوبستراها ..................................................... 20
1-28 هالوفیل ها .................................................................................................................... 20
1-29 اهداف تحقیق ............................................................................................................. 21
1-30 سوالات تحقیق ........................................................................................................... 22
1-31 فرضیه های تحقیق ...................................................................................................... 22



فصل دوم
پیشینه پژوهش
2-1 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت .................................................................. 24
2-2 بیوتکنولوژی در خدمت صنعت و نفت ....................................................................... 24
2-3 استخراج نفت ............................................................................................................... 26
2-4 حفر چاه ........................................................................................................................ 27
2-5 روش های استخراج نفت ............................................................................................ 27
2-6 مزایای بیوسورفکتانت ها در استخراج نفت ثالثیه ...................................................... 31
2-7 پیشینه تحقیق ................................................................................................................ 32
فصل سوم
روش کار
3-1 دستگاههای مورد استفاده ............................................................................................  39
3-2 وسایل مورد نیاز ...........................................................................................................  39
3-3 مواد مورد استفاده ........................................................................................................  40
3-4 مراحل انجام آزمایش ..................................................................................................  40
3-4-1 نمونه برداری ...........................................................................................................  41
3-4-2 غربالگری و غنی سازی بی هوازی باکتری های نفتی ..........................................  41
3-4-3روش تهیه لام ........................................................................................................... 43
3-4-4 رنگ آمیزی گرم .................................................................................................... 43
3-4-5 رنگ آمیزی منفی ................................................................................................... 44
3-4-6 شناسایی و تخلیص ................................................................................................. 44
 3-4-7 تست احیای نیترات ............................................................................................... 46
3-4-8 تست CHNS......................................................................................................... 46
3-4-9 آزمایش های وجود بیوسورفکتانت در نمونه های آزمایش شده ......................... 48




فصل چهارم
نتایج
4-1 مشاهده میکروسکوپی .................................................................................................... 54
4-2 نتایج مرحله شناسایی و تخلیص ................................................................................... 54
4-3 نتایج تست احیای نیترات .............................................................................................. 54
4-4 نتایج تست CHNS .....................................................................................................  55
4-5 نتایج آزمایش های وجود بیوسورفکتانت در نمونه های آزمایش شده .........................57


فصل پنجم
بحث و نتیجه گیری
5-1 مقدمه ............................................................................................................................ 59
5-2 بحث ............................................................................................................................ 61
5-3 نتیجه گیری .................................................................................................................. 63
5-4 پیشنهادات ..................................................................................................................... 64
پیوست الف .......................................................................................................................... 65
منابع فارسی ........................................................................................................................... 66
منابع لاتین ............................................................................................................................. 66


فهرست جداول

4-1 نمونه شاهد برای تست CHNS................................................................................... 55
4-2 نتایج بدست آمده از نمونه محیط کشت MSMبرای تست CHNS...................... 56

چکیده
مبحث حضور باکتریها در اعماق زمین در اوایل قرن 21 مطرح شد. یکی از اولین تحقیقاتی که در مورد میکروبیولوژی اعماق زمین انجام شد منتج به جداسازی باکتریهای احیا کنندة سولفات از چاه نفت شد. باکتری های احیا کننده سولفات، اصلی ترین باکتریهایی هستند که باعث ترش و اسیدی شدن نفت شده و در نتیجه افت کیفیت نفت خام را به بار خواهند آورد. رقابت بین SRB ها و باکتریهای بیهوازی احیا کننده نیترات برای کسب سوبسترای هیدروکربنی امروزه به عنوان یکی از راه¬حلهای بالقوه بیوتکنولوژیک در جهت ارتقا کیفیت API نفت خام مطرح می¬شود. لذا تحقیق در مورد یافتن NRBهای بومی نفت خام هر منطقه جغرافیایی تبدیل به یکی از موضوعات مورد توجه دانشمندان صنعت نفت در دهه اخیر شده است. از مهمترین ویژگیهای یک باکتری مفید در بیوتکنولوژی نفت توانایی تحمل شرایط فیزیکو شیمیایی دشوار مخزنی و تولید بیو سورفکتانت جهت افزایش دسترسی میکروبی می¬باشد. لذا در این تحقیق باکتریهای بی¬هوازی هالوفیل، احیاکننده نیترات  و مولد بیوسورفکتانت بومی نفت خام ایران بررسی شدند. نمونه نفتهایی از برخی مخازن ایران با هدف بررسی حضور باکتریهای احیاکننده نیترات بومی مورد مطالعه قرار گرفت. تمامی کشتها به روش Hungate در ویالهای crimped seal شده و تنظیم اتمسفر بی هوازی، تحت شرایط کاملا بی هوازی در دمای  40درجه سانتیگرادصورت گرفت. در تمامی مراحل هالوفیل بودن باکتریهای جدا شده با افزودن NaCl به محیطهای کشت لحاظ شد. از محیط نوترینت براث و BSM فاقد منبع گوگرد که حاوی نفت خام استریل به عنوان تنها منبع کربن و انرژی بود، به منظور حذف SRB رقیب و غنی سازی اولیه استفاده شد. در مرحله بعد، نیترات براث برای جداسازی و خالص سازی باکتریهای هدف مورد استفاده قرار گرفت، سپس در محیط MSM تجدید کشت شد. جهت بررسی توانایی NRB های بومی جداشده در تولید بیوسورفکتانت از محیط کشت Blood Agar  ، BHI و تکنیک پخش شدن نفت  بکار برده شد.  در نهایت برای حصول اطمینان از اینکه باکتریهای بی هوازی جدا شده از نفت خام قطعا از ازت نفت خام برای تامین نیاز خود استفاده میکنند، تست احیای نیترات و تست NCH که جهت بررسی کاهش ازت بود، انجام گرفت.نتایج حاصل نشان داد که نفت خام ایران دارای NRB های به شدت بی هوازی هستند که علاوه بر احیا نیترات و رقابت با SRBها، می¬توانند از آن به عنوان تنها منبع کربن استفاده نمایند. این باکتریها با توانایی تحمل شوری، دما و نیز تولید بیو سورفکتانت میتوانند از کاربردی ترین باکتریها در صنعت نفت در فرایندهایی مثل ارتقائ کیفیت نفت به روش بیولوژیک، کاهش آلودگیهای محیطی و یا ازدیاد برداشت میکروبی نفت (MEOR) در شرایط بیهوازی باشند، که پیشنهاد می شود کاربرد آنها در کاهش ترشی و اسیدیته نفت خام نیز بررسی شود.

فصل اول

کلیات

1-1مقدمه
 نفت که در زبان انگلیسی Petroleum نامیده میشود، از دو کلمهPetra   و  Oleumکه در زبان یونانی به معنی سنگ روغن و یک نوع روغن میباشد، تشکیل شده است که در زبان فارسی معادل مناسبی ندارد. نفت و سایر مواد سوختنی هیدروکربنی به صورتی که ما امروزه آن را میشناسیم، در مخازنی در اعماق زمین وجود دارند. نفت به عنوان یک منبع انرژی در جهان محسوب می شود و با وجود منابع انرژی دیگر هنوز هم منبع انرژی غالب و در دسترس و قابل اطمینان جایگزین آن نشده است(9).  
پترولیوم می تواند به صورت فازهای مختلف، از جمله فاز گازی نظیر گاز طبیعی (Natural Gas )، فاز مایع نظیر نفت خام ( Crude Oil ) و فاز جامد مثل قیر ( Asphaltene ) در خلل و فرج و شکستگی های سنگ تجمع می یابد. مهمترین منبع هیدروکربن ها، نفت خام است. نفت خام شامل مقدار کمی ترکیبات آلی اکسیژن دار،  نیتروژن دار و گوگردی و نیز فلزاتی است که به طور شیمیایی به مولکول های آلی متصلند.  انباشته شدن مواد هیدروکربنی در زیر سطح زمین در سنگ هایی صورت می گیرد که توانایی نگه داری و انتقال سیالات را داشته باشند. معمولا نفت خام زیر پوششی از سنگ های غیر قابل نفوذ در محفظه های سنگ های متخلخل به نام مخازن یا (rReservoi) که منحصرا در حوضچه های رسوبی قرار دارند،  محبوس است (10).
تجمع مواد هیدروکربنی به صورت اقتصادی در سنگ مخزن منوط به وجود عوامل متعددی است. به طور کلی وجود پنج عامل برای تجمع اقتصادی نفت و گاز لازم و ضروری است، این پنج عامل عبارتند از :
1-سنگ منشأ بالغ (Mature Source Rock) که تولید هیدروکربن کرده باشد.
2-سنگ مخزن ( Resevoir Rock) که بتواند هیدروکربن را در داخل خود جای دهد.  


3-مهاجرت هیدروکربن بین سنگ منشأ و سنگ مخزن ( Migration Pathway) عملی باشد.  
4-پوش سنگ (Cap Rock ) از خروج نفت از داخل سنگ مخزن جلوگیری می کند.  
5-تله نفتی ( Oil Trap) که در آن نفت به صورت تراوش های سطحی شناخته شده و مورد استفاده بوده اند(9).  
 
شکل 1-1 عنصرهای سیستم نفت


اکتشافات نفت یک دانش بسیار قدیمی و کاربردی است که با جمع آوری قیر از تراوش های طبیعی سطحی به قلمرو علم وارد شد. در آن زمان ها از نفت برای مقاصد پزشکی، گرمایی و همچنین مصارف عایق کاری استفاده می شد.
این مواد در ابتدای کشف به صورت منبع بسیار مهم انرژی تلقی شدند، لیکن با پیشرفت علم و تکنولوژی مدرن، خواص دیگر آنها نیز مورد توجه قرار گرفت و شاید امروز بتوان گفت که ارزش مشتقات پتروشیمی بسیار حایز اهمیت میباشند، زیرا منابع سوختی دیگری وجود دارند که از آنها به عنوان منبع انرژی می توان استفاده نمود، حال آنکه نفت میزان محدودی داشته و چنانچه به اتمام برسد، تهیه مشتقات مهم آن نیز منتفی خواهد شد. لذا تولید صحیح و برنامه ریزی های دقیق در صنعت، نقش بسیار مهمی را ایفا می کنند و با مرور زمان به صورت رکن اساسی این صنعت تلقی می گردند (9).  
1-2 پیدایش نفت
در مورد منشأ و پیدایش نفت نظریه های مختلفی وجود دارد که عبارتند از :
1-2-1 نظریه منشأ معدنی
نظریه معدنی نفت که در ابتدای قرن بیستم به وسیله اکثر شیمی دان ها و زمین شناسان مورد قبول واقع شده بود در حال حاضر فقط جنبه تاریخی دارد.  
در 1901، Sanderens, Sabatier, استیلن را دمای 200-300 درجه سانتی گراد در حضور کاتالیزورهای نیکل و آهن احیاء شده، هیدروژن دار کردند و میزان زیادی از هیدروکربن های موجود  در نفت خام  به دست آوردند. با آنکه نظریه معدنی بودن منشأ نفت در ابتدا به سهولت پذیرفته شده بود طولی نکشید که با ایرادهای زیادی مواجه گشت که منجر به کنار گذاشتن آن شد.
1-2-2 نظریه منشأ آلی نفت
امروزه می توان گفت که نظریه منشاء آلی برای نفت خام نسبت به هر نظریه دیگری قابل قبول تر است.  نفت خام معمولا در لایه های رسوبی یافت می شود و همواره مقدار زیادی مواد آلی در این لایه ها وجود دارند.  
بقایای این مواد اعم از گیاهی و یا حیوانی محتوی مقدار زیادی کربن و هیدروژن هستند که سازنده اصلی نفت خام می باشند.  
به نظر می رسد موجودات بسیار کوچک و بی شماری که در دریاها،  دریاچه ها و مرداب ها زندگی می کنند و پلانکتون نامیده می شوند، منشاء مواد آلی مولد نفت باشند. توزیع پلانکتون ها در سطح دریاها یکنواخت نیست. این موجودات در قسمت بالای آب دریاها ( عمق 50 تا 100 متری ) که اشعه خورشید نفوذ می کند و نیز در مجاورت سواحل متمرکزاند. تولید مثل این موجودات بسیار زیاد است و پس از نابودی در کف دریاهارسوب کرده، قسمت اعظم مواد آلی را تشکیل می دهند که بعدا با رسوب های مختلف مخلوط می شوند، همچنین آب رودخانه هایی که به دریا می ریزند حاوی مقداری مواد هیومیک است که ترکیباتشان نزدیک به هیدروکربن می باشد (11).  
1-3  نفت خام
نفت خام یا پترولیوم نوعی سیال است که به صورت مجموعه ای از هیدروکربن های مختلف، به اشکال مایع و یا گاز در مخازن زیر زمینی وجود دارد. پترولیوم در شیمی و زمین شناسی، اصطلاحا به ترکیبا ت هیدروکربنی اتلاق می شود که توسط چاههای نفت از داخل زمین استخراج می شوند. تصویر اصلی پترولیوم در داخل مخازن به صورت گاز است که به نام گاز طبیعی نامیده می شود. بخشی از پترولیوم در شرایط متعارفی (دمای 15 درجه سانتی گراد و فشار 760 میلی متر جیوه ) به صورت مایع درآمده که به آن نفت خام میگویند و بخش دیگر به همان صورت گاز باقی می ماند (12).
1-4  انواع نفت خام
برای نشان دادن میزان سبکی و سنگینی نفت خام به طور معمول از شاخص ((ای-پی-آی)) (API)
استفاده می شود. نفت های خام API بالاتر از 30 را سبک و 20 تا 30 را متوسط و پایین تر از 20 را نفت خام سنگین می گویند. نفت خام هایی با APIبیشتر از 44 مانند نفت خام « اکوفیسک » نیز وجود دارد که آنها را بسیار سبک می گویند.
((نفت شیرین)) به نفت خامی می گویند که میزان گوگرد آنها کمتر از 5/0 درصد  و ((نفت ترش)) به نفت خامی می گویند که میزان گوگرد آنها بیش از 5/0 درصد باشد.  میزان گوگرد موجود در نفت خام به طور معمولبین 1/0 و 3 درصد وزن نفت خام است.  بیشتر نفت خام های شیرین،  سبک و بیشتر نفت خام های ترش، سنگین هستند (12).