.jpg)
لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت
تعداد صفحات: 15
پاسخ های فیزیولوژیکی و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در گیاه گوجه فرنگی تحت تنش آلومینیوم
چکیده
آلومینیوم از جمله عناصر بسیار سمی است که خاک، آب و زنجیره غذایی را آلوده کرده و تهدیدی جدی برای سلامتی انسان و محصولات کشاورزی است. در پژوهش حاضر کلرید آلومینیوم در هفت غلظت (0، 25، 50، 75، 100 و 125 و 150 میکرومولار) در شرایط کنترل شده بر روی گیاه گوجه فرنگی به مدت 21 روز به کار گرفته شد. نتایج نشان داد تنش آلومینیوم به طور معنی داری محتوی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا را افزایش داد که نشان دهنده القا تنش اکسیداتیو توسط آلومینیوم در گیاه گوجه فرنگی است. همچنین میزان پروتئین در هر دو بخش ریشه و برگ روند کاهشی را به طور معنی داری نشان داد. بررسی مکانیسم های دفاعی، از طریق اندازه گیری فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان نشان داد که تنش آلومینیوم فعالیت آنزیم های سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT) ، گایاکول پراکسیدازها ( (POX، آسکوربات پراکسیداز (APX)و پلی فنل اکسیداز (PPO) را افزایش داد. تجمع آلومینیوم در برگها ابتدا افزایش و سپس در غلظتهای بالاتر از آلومینیوم کاهش یافت اما در سیستم ریشهای افزایش قابل توجهی در تجمع آلومینیوم در غلظتهای بالای Al (150 میکرومولار آلومینیوم) مشاهده شد. افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشا در شرایط تنش آلومینیوم، نشان داد که سرکوب رادیکال های آزاد اکسیژن خارج از توان گیاه به خصوص در تیمارهای 75 تا 150 میکرومولار بوده است و القا مکانیسم های دفاع آنزیمی گیاه در مقابل صدمات اکسیداتیو موثر نبوده است. بنابراین استفاده از ترکیبات حفاظتی برون زا می تواند ظرفیت آنتی اکسیدانی این گیاه را در برابر شرایط تنش افزایش دهد.
واژه های کلیدی: آلومینیوم، آنزیم های آنتیاکسیدان، پروتئین، گوجه فرنگی، مالون دی آلدئید
نویسنده مسئول: نشانی پست الکترونیکی: F_Najafi@yahoo.com
مقدمه
آلومینیوم سومین عنصر فراوان پوسته زمین (Achary et al.,2008)بعد از اکسیژن و سیلیسیم است (Chen et al., 2010) که تقریبا 7 درصد از جرم پوسته زمین را در بر میگیرد (Giannakoula et al., 2008). با کاهش pH خاک، فعالیت آلومینیوم در خاک و در نتیجه سمیت آن برای گیاه افزایش قابلتوجهی پیدا میکند (Dong et al., 2002) همچنین اسیدی شدن خاک در سراسر جهان در نتیجه فعالیت انسان ها (افزایش آزادسازی آلایندههای صنعتی و استفاده مداوم از کودهای آمونیاکی یا حاوی آمید) در حال افزایش است .(Tabaldi et al., 2009) تنشهای زیستی و غیر زیستی منجر به شکلگیری گونههای اکسیژن واکنشپذیر (ROS) میشود. تولید گونه های اکسیژن فعال سبب پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء، تخریب پروتئینها و نوکلئیک اسیدها می شود (Jiang and .Zhang, 2001) گیاهان برای کاهش دادن اثر مخرب گونه های اکسیژن فعال مکانیسم های متفاوتی دارند. از جمله این مکانیسمها میتوان به سیستم دفاع آنتی اکسیدانی اشاره کرد. این سیستم شامل سیستم آنزیمی و غیرآنزیمی است. آنزیمهای آنتی اکسیدان مانند کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز در پاکسازی رادیکالهای آزاد اکسیژن در سلول نقش دارند .(Agarwal and Pandey, 2004) در پاسخ به افزایش تولید گونه های فعال اکسیژن، ظرفیت دفاع آنتی اکسیدانی و فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان افزایش می یابد .(Gressel and Galun, 1994) اولین آنزیم پاکسازی کننده سوپراکسید دیسموتاز است که تبدیل رادیکال سوپراکسید به پراکسیدهیدروژن که یک مولکول با خاصیت غیررادیکالی است را بر عهده دارد. پراکسید هیدروژن تولید شده توسط آنزیم کاتالاز و یا آسکوربات پراکسیداز تبدیل به آب و اکسیژن می شود(Comba et al., 2010) . آنزیم پراکسیداز نقش مهمی را در جاروب کردن پراکسید هیدروژن دارد که این عمل با کمک اسید آسکوربیک به عنوان یک دهنده الکترون برای احیای پراکسید هیدروژن به آب صورت می گیرد. درطی این واکنش اسید آسکوربیک به مونودهیدروآسکوربات تبدیل می شود. گایاکول پراکسیدازها (POX) گلیکوپروتئینهایی هستند که فنلها را مانند یک دهنده هیدروژن مصرف کرده و در فرایندهای نمو، لیگنین سازی، بیوسنتز اتیلن، دفاع و التیام زخمها شرکت میکنند(Verma and Dubey, 2003 ; .Michalak, 2006) تغییرات در میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان در شرایط تنشهای محیطی مختلف گزارش شده است .(Hernandez et al., 2000) همچنین تخریب پروتئین ها و انباشت برخى آمینواسیدهاى آزاد در جهت حفظ وتنظیم فشار اسمزى سلول و کاهش سنتز پروتئین در شرایط تنش مشاهده شده است (Hissao, 1973 ; Moran et al., 1994) . برخى از پژوهشگران رکود سنتز پروتئین را به کاهش تعداد پلى زوم هاى سلولى نسبت داده اند .(Creelman et al., 1990)یکی از واکنشهایی که در حضور انواع اکسیژن فعال سرعت بیشتری پیدا می کند، پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی است که باعث تولید آلدئیدهایی مثل مالون دی آلدئید(MDA) و ترکیباتی مثل اتیلن می شوند .(Qiujie et al., 1996) اثر رادیکالهای اکسیژن بر لیپیدها و پراکسیداسیون آنها ناشی از اثر بر پیوندهای دوگانه اسیدهای چرب غیراشباع می باشد که واکنشهای زنجیرهای پراکسیداسیون را تحریک کرده و منجر به تخریب اسیدهای چرب میشوند. رادیکالهای هیدروکسیل و یا اکسیژن یکتایی می توانند با گروههای متیلن اسیدهای چرب غیر اشباع واکنش داده و تولید رادیکالهای لیپید پراکسی و هیدروپراکسی کنند (Bandyopadhyay et al., 1999).
گوجه فرنگی گیاهی با کاربرد فراوان در میان سبزیجات در دوره های متفاوت کشت و زراعت است همچنین بخش وسیعی از این محصول در گل خانه کشت می شود و استفاده از سوبستراهای ویژه و تکنیک های کوددهی و آبیاری در آن درگیر است (Gil et al., 2004 ; Huang and Jin, 2008). بنابراین ریسک تجمع عناصر سنگینی مانند آلومینیوم در این گیاهان افزایش می یابد. در نتیجه نیاز به بررسی پاسخ فیزیولوژیکی محصولات غذایی مانند گوجه فرنگی به سمیت این فلزات ضروری به نظر می رسد. بررسی مکانیسم سازگاری به تنش آلومینیوم، می تواند بینش جدیدی درباره ی فرایند تنش آلومینیوم در این گیاه ایجاد کند و یا حتی مقاومت محصولات را به تنش آلومینیوم بهبود بخشند. هدف از انجام این پژوهش بررسی اثر تنش آلومینیوم برالقاء تنش اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپید، تخریب پروتئین و بررسی سیستم دفاع آنتی اکسیدانی گیاه گوجه فرنگی در غلظت های متفاوت آلومینیوم است.
مواد و روشها
کشت و تیمار گیاه : بذرهای گیاه گوجهفرنگی (Mill. (Lycopersicon esculentum از موسسه بذر و نهال کرج تهیه شد. تعداد 500 عدد بذر یکنواخت و همگن انتخاب شدند و برای جلوگیری از آلودگی قارچی توسط هیپوکلریت سدیم 1 درصد به مدت 10 دقیقه ضدعفونی شدند. پس از این مرحله تعداد 10 عدد بذر درون ظروف پتری سترون حاوی یک لایه کاغذ صافی قرار داده شدند. سپس ظروف پتری فوق با ورق آلومینیومی پوشانده شدند. بعد از 4 روز بذرها جوانه زدند. از بین آنها، بذرهای جوانه زده یکنواخت انتخاب شدند. گیاهکهای 6روزه به گلدانهای حاوی ماسه مرطوب شده با آب مقطر منتقل شدند. در کف گلدانها چندین منفذ کوچک وجود داشت تا آب ماسه در حد ظرفیت مزرعه باشد و سپس گلدانها به شرایط نوری مناسب انتقال داده شدند و به مدت 14 روز با محلول هوگلند آبیاری شدند. زمانی که گیاهان 20 روزه شدند تیماردهی آغاز شد. گیاهان تحت تیمار کلرید آلومینیوم (AlCl3) در غلظت های 0، 25 ، 50 ، 75 ، 100 ، 125 و 150 میکرومولار قرار گرفتند. در طول دوره تیماردهی، هفته ای سه بار گلدان ها با محلول غذایی مورد نظر (محلول هوگلند به همراه تیمارهای کلرید آلومینیوم) آبیاری شدند. برای جلوگیری از انباشته شدن اضافی یون ها در هنگام آبیاری، نیمی از محلول مورد استفاده از ته گلدان ها خارج می شد و در فواصل تیماردهی گلدان ها با آب مقطر آبیاری شدند که این کار از طریق زیرگلدانی صورت می گرفت. درجه حرارت 25 درجه سانتی گراد در روز و 18 درجه سانتی گراد در شب در نظر گرفته شد. طول دوره روشنایی و تاریکی به ترتیب 16 و 8 ساعت تنظیم شد. pH در تمام محلولهای غذایی تهیه شده در حد 5/5 تنظیم گردید. برای به حداقل رساندن اثرات میکروکلیمایی در محیط رشد گیاه در گلخانه گردش وضعی و جابه جایی تصادفی گلدانها به صورت روزانه در دوره رشد انجام پذیرفت. گیاهان 40 روزه جهت سنجشهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی برداشت شدند.
سنجش پراکسیداسیون لیپید: اندازهگیری میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی به وسیله تست تیوباربیتوریک اسید (TBAT) با سنجش میزان مالوندیآلدئید انجام شد. 2/0 گرم بافت تر برگ و ریشه در 5 میلی لیتر تری کلرواستیکاسید (TCA) 1/0 درصد همگن شده سپس عصاره ی حاصل به فالکون انتقال یافته و به مدت 5 دقیقه در g 6000 سانتریفیوژ شد. به یک میلی لیتر از محلول رویی 4 میلی لیتر تری کلرواستیک اسید 20 درصد که حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریکاسید بود اضافه شد. مخلوط فوق به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم (95 درجه سانتی گراد)، انکوبه گردیدند. سپس مخلوط حاصل بلافاصله در حمام یخ سرد شد و بعد از آن در سرعت g 6000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید. میزان جذب مایع رویی در طول موج 532 نانومتر تعیین و جذب ناویژه در 600 نانومتر از آن کسر شد. غلظت مالوندی آلدئید (MDA) با استفاده از ضریب تصحیح (μ mol-1 cm-1) 155/0 محاسبه و براساس واحد میکرومول بر گرم وزن تر (μmol g-1 FW) بیان شد .(Health and Packer, 1968)
سنجش پروتئین : اندام هوایی و ریشه تازه گیاهان پس از توزین ، توسط 2 میلی لیتر بافر فسفات 1/0 مولار (8/6(pH به صورت هموژن درآمد. پس از همگن سازی، هر کدام از نمونه ها به ویال های 2 میلی لیتری منتقل شدند. سپس سانتریفوژ نمونه ها درg 15000 به مدت 12 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد انجام شد. از بخش رویی عصاره جهت سنجش غلظت پروتئین کل عصاره های گیاهی با استفاده از روش برادفورد (1976) استفاده شد (Bradford, 1976).
سنجش فعالیت آنزیم:
سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز : مخلوط واکنش برای سنجش فعالیت آنزیم شامل بافر فسفات 50 میلی مولار، متیونین 013/0 مولار، EDTA 1/0 میکرومولار و ریبوفلاوین 2 میکرومولار می باشد که در تاریکی کامل نگهداری شد. بلافاصله پس از اضافه کردن ریبوفلاوین، 3 میلی لیتر از آن را درون لوله آزمایش ریخته و به هر لوله 100 میکرولیتر نمونه عصاره پروتئینی اضافه شد. لولههای آزمایش به مدت 16 دقیقه در فاصله 30 سانتیمتری از منبع نور قرار گرفتند و در این فاصله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 560 نانومتر و توسط محلول تاریکی به عنوان شاهد تنظیم شد. پس از 16 دقیقه جذب نمونهها در طول موج مذکور خوانده شد. از آنجائیکه یک واحد آنزیم مذکور عبارت است از میزانی از آنزیم که 50 درصد بازداشت ایجاد می کند، فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز براساس واحد آنزیمی به ازای هر میلی گرم پروتئین برای تمام نمونهها محاسبه گردید (Giannopolitis et al., 1997).
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز : بررسی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) با بررسی کاهش مقدار پراکسید هیدروژن در طول موج 240 نانومتر انجام شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی مولار (7 pH) و پراکسید هیدروژن 15 میلی مولار بود. واکنش با افزودن 100 میکرولیتر عصارهی آنزیمی در حجم نهایی 3 میلی لیتر آغاز گردید. تغییرات جذب در 240 نانومتر به مدت 3 دقیقه ثبت شد. سپس فعالیت آنزیم به صورت تغییرات جذب در دقیقه به ازای وزن تر بیان گردید .(Dazy et al., 2008)
سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: برای سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز، مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 250 میلی مولار(7pH )، آب اکسیژنه 2/1 میلی مولار، اسید آسکوربیک 5/0 میلی مولار و EDTA 1/0 میلی مولار بود. با اضافه کردن آب اکسیژنه به مخلوط واکنش فعالیت آنزیمی شروع شد. کاهش جذب نور به علت پراکسیداسیون اسید آسکوربیک در طول موج 290 نانومتر به مدت 2 دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. برای محاسبه فعالیت آنزیم از تغییرات جذب در یک دقیقه استفاده شد .(Dazy et al., 2008)
سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز: فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX)، به صورت زیر مورد ارزیابی قرار گرفت. محیط واکنش شامل بافر پتاسیم فسفات 25 میلی مولار (8/6pH ) و پراکسید هیدروژن 40 میلی مولار و گایاکول 20 میلی مولار بود. واکنش با افزودن 100 میکرولیتر عصاره ی آنزیمی در حجم نهایی 3 میلی لیتر آغاز گردید. افزایش جذب به وسیلهی تشکیل تتراگایاکول در طول موج 470 نانومتر به مدت 3 دقیقه ثبت شد. سپس فعالیت آنزیم به صورت تغییرات جذب در دقیقه به ازای هر گرم وزن تر در دقیقه بیان گردید (Dazy et al., 2008).
سنجش فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز: سنجش فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز از روش ریموند (1993) استفاده شد. ابتدا تعدادی لوله آزمایش در حمامی با دمای 40 درجه سانتی گراد گذاشته شد. سپس بافر فسفات 2/0 مولار با 6 pH و پیروگالل 02/0 مولار به هر یک از لولهها افزوده شد. پس از رسیدن دمای لولهها دقیقا به 40 درجه به هر لوله 2/0 میلی لیتر عصاره افزوده شد و تغییرات جذب در 430 نانومتر خوانده شد(Raymond et al., 1993).
سنجش میزان تجمع عنصر آلومینیوم : برای سنجش میزان آلومینیوم ریشه و برگ 5/0 گرم از وزن تر ماده گیاهی (برگ و ریشه) به دقت وزن شد و در بوته چینی قرار داده شد و در دمای 500 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت در کوره سوزانده شد. سپس خاکستر حاصل در 5 میلی لیتر از اسیدنیتریک غلیظ به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق
تحقیق درباره پاسخ های فیزیولوژیکی و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در گیاه گوجه فرنگی تحت تنش آلومینیوم
